机体的免疫系统是一个复杂的网络调控体系,由固有免疫和适应性免疫组成,能够募集一系列细胞和分子阻止病原微生物的侵入和肿瘤的发生发展.目前人们发现了很多机制来解释肿瘤的免疫逃逸和免疫抑制,其中,肿瘤诱导产生的具有负向调控机体免疫反应的抑制性细胞(如调节性 T 细胞,Treg等)近年来被广为研究,越来越多的资料表明一群具有Gr-1和CDllb标志的髓系来源的抑制性细胞(CDllb<+>G-1<+>myeloid suppressor cells,MSCs)在荷瘤小鼠的脾脏、骨髓、淋巴结、肿瘤原发部位和浸润组织中大量聚积,该细胞亚群能够负向调节荷瘤宿主的免疫功能,与肿瘤进展关系十分密切.因此,有关MSCs与肿瘤免疫逃逸的研究倍受瞩目,成为近年来肿瘤免疫学领域的研究热点. MSCs于上世纪80年代初被发现,曾被称为不成熟髓系细胞(immaturemyeloid cells,IMCs) 和自然抑制细胞 (natural suppressor cells,NSCs),是一类异质性的细胞群体,主要由处于早期分化阶段的髓系细胞组成,包括不成熟的巨噬细胞、粒细胞和髓样树突状细胞等,在琼脂中可形成和髓系前体细胞具有相同表型的细胞克隆.除了表达巨噬细胞谱系标志CD11b和粒细胞谱系标志Gr-1外,MSCs还表达不同水平的CD31、ER-MP54和ER-MP58等髓系细胞分化抗原,但MSCs低表达甚至不表达MHCII分子以及CD86、CD40等共刺激分子. 人们很早就在肿瘤患者和动物模型中观察到,MSCs的数量随着疾病的进展而日益增多,并且与肿瘤的大小成正相关,大量的MSCs堆积往往预示不良预后.目前关于MSCs免疫抑制作用的机制报道很多,包括通过精氨酸耗竭、表达和分泌NO和TGF等,相关报道大多集中在MSCs抑制肿瘤特异性T细胞功能的研究上,而有关MSCs影响NK细胞功能的研究尚无正式报道.NK细胞占淋巴细胞的5-10﹪,而且存在于肝脏、腹腔和胎盘等外周组织.NK细胞能不受MHC分子的限制而非特异性杀伤病原微生物和肿瘤,是机体免疫系统的第一道防线.NK细胞能通过释放毒性颗粒(perforin和granzyme)、细胞因子(IFN-γ,TNF-a)或表达TNF超家族配体(TNF,TRAIL,FASL等)诱发凋亡等对肿瘤细胞发挥杀伤作用;还能通过其表面Fc受体结合肿瘤细胞上的抗体发挥抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC);并且能产生IFN-γ、TNF-a、GM-CSF、IL-5、IL-10以及IL-13等细胞因子参与免疫调节,同时影响固有免疫和适应性免疫.NK细胞不仅监视控制肿瘤的发生,而且对控制肿瘤的转移也发挥十分重要作用,在机体抗肿瘤免疫反应中起着不可或缺的作用.由于表面没有抗原特异性受体,NK细胞通过识别MHC Ⅰ类分子的抑制型受体和识别非MHC I类分子的活化型受体分别传递抑制信号和活化信号而区分正常细胞和突变细胞.由于NK细胞识别肿瘤细胞不受MHC限制,因此其对某些低表达MHC分子的肿瘤细胞仍具有很强的杀伤活性. 尽管MSCs聚积和NK细胞功能受损同时发生于荷瘤小鼠和肿瘤患者体内,但两者是否存在因果关系目前还未确定.为此,我们选择了3LL原位肺癌和Hepa原位肝癌小鼠模型作为研究对象以阐明在肿瘤状态下MSCs聚积和NK细胞功能受损之间存在的潜在关系.我们发现,随着Hepa原位肝癌的进展,MSCs占脾细胞的数量从正常小鼠(荷瘤0天)的4-6﹪上升到荷瘤21天的20-40﹪;而NK细胞对Yac-1淋巴瘤细胞的杀伤活性显著下降.为了进一步明确抑制NK细胞肿瘤杀伤功能的具体因素,我们检测了荷瘤小鼠脾脏 NK 细胞一系列活化型受体(Ly49D、CD94NKG2C和NKG2D)、抑制型受体 (Ly49A/C 和 CD94NKG2A)以及一些参与NK细胞介导的细胞毒性效应的分子如 perforin、granzyme B、FasL和Trail的表达.我们发现,随着肿瘤的发展,NKG2D<+>NK细胞比例和NKG2D的平均荧光强度 (MFI) 随着肿瘤负荷的进展而逐渐下降,而其他几个分子则没有明显的变化.利用 3LL 肿瘤模型也得到了相似的实验结果.为了阐明NKG2D在NK细胞介导的杀伤效应中的重要作用,我们在正常 NK 细胞与Yac-1共培养体系中加入抗NKG2D单克隆抗体,结果发现该抗体能非常有效地阻断NK细胞的细胞毒活性.据此我们推测,在肿瘤状态下,MSCs可能通过下调NK细胞表面NKG2D的表达水平而抑制NK细胞的杀伤能力. 为了证实以上猜测,我们将分别来源于正常和荷瘤小鼠脾脏的NK细胞和MSCs按1∶1的比例在体外共培养.从3h开始,MSCs就具有抑制NK细胞杀伤活性的作用,并且随着共培养时间的延长其抑制作用逐渐增强,在12h时达到高峰.NK细胞NKG2D的表达水平也出现了相似的变化趋势,提示MSCs可以通过下调NKG2D的表达水平而抑制NK细胞的杀伤能力. 为了进一步证实MSCs在体内也能抑制NK细胞的杀伤功能,我们采用了体内过继回输MSCs的实验方法.将流式细胞仪分选的MSCs (纯度>97﹪)采用腹腔注射的方式回输给C57BL/6小鼠(3×10<6>/只), 分别于12h、18h和24h后检测MLN和脾脏NK细胞的杀伤活性和NKG2D的表达水平.体内回输MSCs在24h内就产生对NK细胞的显著抑制作用;其中,MSCs回输12h后,MLN的NK细胞杀伤活性就可以被明显的抑制,而在脾脏需18h方被抑制,其原因可能是由于MSCs回流至MLN要早于脾脏所致.为了进一步证实MSCs的聚积导致荷瘤宿主体内NK细胞功能的受损,我们采用抗MSCs单克隆抗体剔除荷瘤小鼠(荷瘤21天)体内MSCs的策略.我们发现,体内MSCs剔除24h后就可以出现NK细胞杀伤活性和NKG2D表达显著上调. 通过以上的体外和体内实验,我们认为MSCs能够通过下调NKG2D的表达而抑制NK细胞的肿瘤杀伤功能.为了进一步研究MSCs以何种方式(可溶性分子或者细胞直接接触)发挥抑制作用,我们采用了以下的实验方法并发现:将MSCs和NK细胞置入Transwell隔离系统培养, MSCs并不能抑制NK细胞NKG2D的表达;与1﹪多聚甲醛固定后的MSCs共培养12h后,NK细胞的NKG2D表达明显下调.这些结果表明MSCs是通过细胞直接接触而发挥抑制作用的,并且可能通过膜上的某些分子介导.TGF-β是最常见的抑制性分子之一,肿瘤细胞和抑制性细胞常可以借助可溶性或者膜结合型TGF-β来负向调控荷瘤宿主的免疫应答,因此我们推测MSCs是否可能以膜结合型TGF-β来抑制NK细胞的功能.为此,我们设计了如下实验:1)、在MSCs-NK细胞共培养体系中添加抗TGF-β单克隆抗体(anti-TGF-β mAb,10 ng/ml)或者同型对照抗体(Isotype,10 ng/ml);2)、在来源于正常小鼠脾脏NK细胞的培养基中加入可溶性的重组TGF-β(rTGF-β,1 ng/ml);3)、将MSCs和来源于Smad3功能缺陷小鼠(TGF-β信号转导缺陷)的脾脏NK细胞共培养.结果表明,抗TGF-β单克隆抗体可以阻断MSCs对NK细胞的细胞毒活性和NKG2D表达的抑制作用;可溶性的重组TGF-β并不能抑制NK细胞的细胞毒活性和NKG2D表达; MSCs并不能抑制来源于Smad3功能缺陷小鼠脾脏NK细胞的细胞毒活性和NKG2D表达.至此,我们可以认为MSCs对NK细胞的抑制作用是通过膜结合型TGF-β介导的,并且有赖于细胞和细胞之间的直接接触而实现.那么,MSCs细胞膜表面是否表达膜型TGF-β呢?为了证实这一疑问,我们将流式分选的新鲜MSCs(源自荷瘤21天小鼠脾脏)用DAPI、APC标记的抗Gr1抗体和FITC标记的抗TGF-β1抗体进行标记,激光共聚焦显微镜下观察证实了膜TGF-β1表达于MSCs细胞膜表面. CD4<++>CD25<+>Treg细胞在维持外周免疫耐受中起着十分重要的作用,近年研究表明该细胞亚群能够抑制肿瘤患者和荷瘤小鼠体内的NK细胞功能,促进肿瘤的生长和转移.为了明确MSCs和Treg在肿瘤生长发展过程中的作用,我们分析比较了两者在两种肿瘤模型肝脏淋巴细胞和脾细胞中所占的百分率.我们发现,荷瘤小鼠(21天,3LL原位肺癌和Hepa原位肝癌)脾细胞中Treg的比例较高(14-16﹪),而肝脏淋巴细胞中Treg的比例很低(2-4﹪);荷瘤小鼠肝脏淋巴细胞中MSCs的比例从正常小鼠的4-7﹪增加到荷瘤21天的40-50﹪,NKG2D<+>NK细胞则从正常小鼠的30-50﹪T降到荷瘤21天的4-9﹪.据此,我们认为MSCs诱导NK细胞功能抑制是除Treg之外的新的肿瘤免疫逃逸机制,而且是维持肝脏原位免疫耐受的重要机制. 综上所述,我们的实验结果提示荷瘤宿主体内MSCs聚积下调了NK细胞NKG2D的表达从而抑制NK细胞的肿瘤杀伤功能,这种作用是通过膜结合型TGF-β介导的,并且有赖于细胞和细胞之间的直接接触而实现.该结果为肿瘤免疫逃逸机制的研究增添了新的认识.