论文部分内容阅读
目的:本课题旨在探求中药消痈生肌法治疗消化性溃疡的疗效,通过对胃溃疡大鼠治疗后在病理组织学、分子生物学、血清学等方面研究对比,以及本方在消化性溃疡患者中的疗效观察,探索本方治疗消化性溃疡的作用机制及对临床应用的价值。材料与方法:1材料1.1研究对象动物实验:SPF级SD雄性大鼠70只,体重(200±10)g,随机将大鼠分为7组,即正常对照组、假手术组、模型组、消痈溃得康组、中药汤剂组、溃疡胶囊组、奥美拉唑组,每组10只。临床实验:待检胃粘膜标本来自辽宁中医药大学附属医院胃镜室,胃镜活检组织保存于液氮中待用,其中胃溃疡10例,慢性糜烂性胃炎10例,慢性浅表性胃炎9例。临床观察:病例均为2007年2月至2008年10月符合入选标准的本院门诊患者,共60例,按随机数字表法分为2组。治疗组30例,对照组30例。1.2药物与试剂消痈生肌方,消痈溃得康,溃疡胶囊,奥美拉唑镁肠溶片,三叶因子2上下游引物,西咪替丁片。100%冰乙酸,10%水合氯醛溶液,10%甲醛溶液,IL-1β,IL-2 ELIASA酶免疫试剂盒;抑肽酶;NO,NOS试剂盒;焦碳酸二乙酯(DEPC);琼脂糖;嗅化乙锭(EB);TRIZOL液;异丙醇;氯仿;DNA-marker DL2000;RT-PCR试剂盒;100%乙醇。1.3主要实验仪器电热恒温水温箱,恒温震荡器,TDL-5A台式离心机,721B分光光度计,LeicaRM2135切片机;Olympus光学显微镜;1601紫外分光光度计;INFINITE M200酶标仪;SN-682型放射免疫r计数器;游标卡尺;Milli-Q超纯水机;DY89-Ⅰ电动玻璃匀浆机;JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机;DU-600蛋白核酸分析仪;BIOFUGE28RS低温高速离心机;Indeslt低温冰箱;PE9600 PCR仪;EPS-300电泳仪;DYCP-33A电泳槽。2方法2.1动物实验部分将传统冰乙酸烧灼法加以改良,制备大鼠胃溃疡模型。普通人按体重60kg计算,人与200g体重大鼠折算比为6.25:1,计算出每种药物的对应浓度:消痈生肌方1.28g/kg,消痈溃得康0.2 g/kg,溃疡胶囊0.018 g/kg,奥美拉唑肠溶片0.2 mg/kg。各组实验大鼠从造模后第2天开始灌胃,早晚各一次,共12天。正常组,正常饲养,不进行灌胃;假手术组、模型组,每日灌胃蒸馏水2ml,早晚各一次;汤药组,每日灌胃1.28g/kg浓度的消痈生肌方溶液2ml,早晚各一次;溃得康组,每日灌胃0.2g/kg浓度的消痈溃得康溶液2ml,早晚各一次;胶囊组,每日灌胃0.018g/kg浓度的溃疡胶囊溶液2ml,早晚各一次;奥美组,每日早晨灌胃1.28g/kg浓度的奥美拉唑肠溶片溶液2ml,晚上灌胃蒸馏水2ml。灌胃12天,禁食一晚后取材。各组大鼠用10%水合氯醛麻醉,开腹,找到胃,在幽门、贲门两端剪断,将胃取出,取胃液;沿胃大弯剪开,用生理盐水清洗,在洁净工作台将胃壁展平,观察溃疡情况,然后沿溃疡边缘3mm切下胃壁,制作HE染色的病理切片。拨开肠管、网膜找到腹主动脉,用头皮针刺入,取血约5ml,每ml血中加入抑肽酶10μl,混匀,凉置2小时;再以3000转/分钟离心10分钟,取上部血清,装入EP管中,按组别1-70编号标记,冷冻备用。观测指标:胃黏膜大体形态观察、溃疡面积的测定、胃液PH值测定、胃黏膜病理组织检查,ELISA法检测大鼠血清IL-1β,IL-2,硝酸还原法测定NO含量,比色法测定血清中NOS水平。2.2临床部分将各组患者胃粘膜标本加入1ml TRIZOL试剂,用组织剪剪碎,用细胞粉碎机破碎,做总RNA的提取,反转录反应,PCR反应,琼脂糖电泳,得出TFF2的反应条带。治疗组予消痈生肌方治疗。每天1剂,水煎,取汁300mL,分3次口服。对照组予胃热清胶囊治疗。每次4粒,每日3次。两组均治疗2月为1疗程,同时加服西咪替丁200mg,每日三次口服。治疗期间停用其他药物,并避免进食粗糙、辛辣等刺激性食物,戒烟酒。主要观察临床症状及纤维胃镜改变、复发率及不良反应。结果:1.模型组溃疡面积明显大于正常组和假手术组(P＜0.01),但各组与正常组间仍有差异(P＜0.01);胶囊组、奥美组与模型组比较有显著性差异(P＜0.01),汤药组和溃得康组的溃疡面积明显小于奥美组和胶囊组,汤药组与其它各对照组存在着差异(P＜0.05)。汤药组与奥美组的胃酸值比较无显著性差异(P＞0.05)2.汤药组中IL-1β含量高于正常组、假手术组,与之比较有非常显著性差异(P＜0.01);汤药组中IL-1β含量低于溃得康组、胶囊组、奥美组,与之比较有非常显著差异(P＜0.01);模型组含量最高,各组与之比较均有非常显著性差异(P＜0.01);溃得康组与奥美组比较,无显著差异(P＞0.05)。汤药组中IL-2含量低于正常组、假手术组,与之比较有非常显著性差异(P＜0.01);汤药组中IL-2含量高于溃得康组、胶囊组、奥美组,与之比较有非常显著差异(P＜0.01);模型组含量最低,各组与之比较均有非常显著性差异(P＜0.01);溃得康组与奥美组比较,无统计学意义(P＞0.05)。3.本实验结果显示,汤药组NO含量明显高于模型组,也高于胶囊组,低于正常组和假手术组;溃得康组与汤药组比较,略高于后者;奥美组NO含量高于各治疗组,甚至高于正常组和假手术组;胶囊组的NO含量仅高于模型组,低于其它各组。汤药组的NOS活力均高于各对照组,溃得康组次之,且明显高于模型组;正常组和假手术组NOS活性最高。4.每个病例胃黏膜TFF2均有表达,浅表性胃炎组表达较强,糜烂性胃炎组次之,而胃溃疡组表达最弱。实验结果显示,溃疡组TFF2表达低于另两组,与糜烂组比较有非常显著性差异(P＜0.01),与浅表组比较也有非常显著性差异(P＜0.01);糜烂组与浅表组比较有显著性差异(P＜0.05),均有统计学意义。5.本观察表明,消痈生肌方治疗胃毒热证消化性溃疡疗效较好,优于对照组的疗效,且复发率低,半年仅复发一例,在用药过程中未发现有心、肝、肾等重要器官及造血系统的毒性损害。结论:1.消痈生肌方能使大鼠实验性溃疡面积缩小,促使胃黏膜上皮细胞增殖,使肉芽组织的迅速生成,促进溃疡愈合,能够通过降低胃液酸度,减轻攻击因素对胃黏膜的损伤,由此我们认为消痈生肌方也具有较强的抑酸能力。2.消痈生肌方能够通过降低和提高大鼠血清中IL-1β,IL-2水平,缓解炎症介质释放、降低炎症反应、增强胃粘膜的防御功能,以此来促进溃疡的愈合。3.消痈生肌方能有效增强NOS活性,调节局部血流,适度提高NO的生成,使之接近正常水平,调节胃酸分泌,维护胃黏膜的完整性和防御功能,调节胃肠黏膜血流量,从而达到促进溃疡愈合的目的。4.三叶因子2在胃溃疡黏膜组织中表达最低,其表达程度与胃粘膜损害程度称负相关,由此我们也可以推断其表达量应远低于正常人。我们认为三叶因子2具有保护胃黏膜屏障,防止攻击因子侵袭的作用。5.我们认为消痈生肌法是一种在临床上疗效确切治疗消化性溃疡的方法,并且有望在抗溃疡复发方面取得一定突破。