背景骨是由成骨细胞和破骨细胞调节的一种精细的动态器官,在调节骨周转率中起着关键作用。成骨细胞对骨形成很重要,破骨细胞负责骨吸收。成骨细胞来源于间充质干细胞和成骨前细胞,通过成骨分化形成。成骨分化功能障碍导致正常骨重塑或骨翻转功能受损,并伴有多种骨代谢紊乱,包括骨质疏松症。骨质疏松症的主要病理特征为骨密度降低、骨稳态崩溃、骨脆性增加。成骨细胞的成熟是一个复杂的生理过程,由细胞增殖、分化、矿化等多个步骤调控。前体细胞成功的分化和矿化成功能性成骨细胞被认为是骨形成的关键步骤。多种细胞内信号通路被报道参与成骨细胞分化和矿化过程。例如,AMPK活化的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)可刺激内皮一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)磷酸化,增加成骨前细胞MC3T3-E1一氧化氮(nitric oxide,NO)的产生,促进成骨细胞分化和矿化,提高成骨细胞活性,促进骨形成。AMPK/eNOS通路的激活导致RUNT相关转录因子2(runt-related transcription factor 2,Runx-2)的表达,该转录因子通过调节碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、骨黏连蛋白(osteonectin)、骨桥蛋白(osteopontin)和Ⅰ型胶原的表达参与成骨细胞成熟。促进成骨分化被认为是治疗骨质疏松症等骨疾病的重要治疗策略。G蛋白偶联受体TGR5是G蛋白偶联受体(G-protein-coupled receptor,GPCR)家族的重要成员。它最初被鉴定为胆汁酸的膜受体。据报道,TGR5在调节胆汁酸和能量稳态以及葡萄糖代谢方面发挥着关键作用。TGR5存在于多种组织和细胞中,通过异三聚体G蛋白转导细胞外信号,具有多种药理特性。例如,最近报道TGR5激活在抑制脂多糖(LPS)诱导的全身急性胃炎症中起关键作用,该过程主要是通过抑制IκBα/NF-κB信号通路的激活完成的。也有报道称TGR5在治疗肾脏炎症相关疾病中具有抑制NF-κB和STAT3信号的作用。TGR5在氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)小鼠模型中也通过减轻神经炎症和改善预后显示其具有神经保护作用。然而,关于TGR5在成骨分化中的作用的信息以前很少有报道。目的本课题拟通过体内和体外实验探究TGR5对成骨细胞分化和骨骼发育形成的影响,以及参与调控成骨细胞正常分化的具体作用机制,不仅研究TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。方法正常成骨细胞分化障碍与骨质疏松等骨丢失相关疾病有关。G蛋白偶联受体TGR5被认为是胆汁酸和能量稳态的重要调节因子。关于TGR5对成骨细胞骨形成和基质矿化的影响,以往报道较少。在本研究中,我们首先利用RNA-seq检测了 β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异,确定了目的基因TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。然后,我们利用TGR5激动剂GPBARA和siRNA技术证明了 TGR5的活性能够调控MC3T3-E1成骨细胞分化相关基因(ALP、OCN、Osx)、成骨细胞分化转录因子Runx2的表达,影响细胞ALP活性及基质钙化。之后,我们通过进一步的机制研究发现TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。最后,我们通过TGR5缺失的转基因小鼠模型体内证明TGR5通过影响AMPK信号通路对小鼠骨骼的发育和成骨细胞的分化产生影响。结果(1)β-GP/AA诱导前成骨细胞系MC3T3-E1前后基因表达差异β-甘油磷酸/抗坏血酸(β-glycerophosphate/ascorbicacid,β-GP/AA)能够诱导成骨细胞的分化和形成。我们利用前成骨细胞系MC3T3-E1作为成骨细胞前体细胞(osteoblastprecursors,OBPs),该细胞能够诱导分化成成骨细胞。我们用4 mMβ-GP和25 μg/mlAA分别处理MC3T3-E1 24h、48h和72h后,收取不同组的RNA,送公司行二代测序。RNA-seq和生物反应路径分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)发现β-GP/AA诱导24h有1488个基因表达上调,诱导48h有1417个基因表达上调,诱导72h有337个基因表达上调,其中TGR5是三组中表达上调最明显的。因此,我们推测TGR5可能参与调控β-GP/AA诱导的成骨细胞的分化与成熟,能够促进成骨细胞前体细胞向成骨细胞的分化。(2)β-GP/AA 诱导促进 MC3T3-E1 TGR5 的表达TGR5在不同类型的细胞和组织中表达。然而,目前尚不清楚TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。因此,我们通过RT-PCR和western blot检测了 TGR5是否在MC3T3-E1细胞中表达。小鼠MIN6细胞作为TGR5表达的阳性对照[16]。与预期一样,通过RT-PCR和western blot分析,我们在MC3T3-E1细胞的RNA水平和蛋白水平分别检测到了 TGR5的表达。接下来,我们发现在成骨培养基(含4mMβ-GP和25 μg/mlAA的α-MEM)培养的MC3T3-E1细胞中,TGR5的表达从第3天到第14天逐步增加,且呈时间依赖性。这些结果提示TGR5可能是MC3T3-E1细胞成骨分化过程中的一个重要因素,说明TGR5参与MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化。(3)TGR5激动剂能够促进MC3T3-E1细胞向成骨细胞的分化GPBARA作为TGR5的特异性激动剂被广泛应用于TGR5的激活研究[17]。前面已经证明TGR5可能参与MC3T3-E1细胞成骨细胞的分化,下面我们利用TGR5特异性激动剂做进一步的验证。我们利用含TGR5激动剂GPBARA(3μM)的成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,然后测定成骨细胞ALP活性、茜素红S染色及成骨细胞分化标志物基因表达情况,用于检测成骨细胞分化情况。结果发现:与对照组相比,GPBARA(3μM)能够显著提高MC3T3-E1的ALP活性,且差异具有统计学意义(p<0.05)。相应地,茜素红S染色结果表明,与对照组相比,添加GPBARA(3μM)能够显著促进MC3T3-E1细胞在第14天的矿化作用,且差异具有统计学意义(p<0.05)。同时,RT-PCR结果表明,TGR5激动剂GPBARA(3μM)的使用能够显著增强成骨细胞相关标记基因的表达,包括ALP、OCN、Osx和Col-I,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(4)TGR5能够促进MC3T3-E1成骨细胞特异性转录因子Runx2的表达与成骨细胞分化相关的标记基因的表达主要受转录因子Runx-2调控。结果发现,与对照组相比,GPBARA(3μM)处理能够显著促进MC3T3-E1Runx2的表达,且差异具有统计学意义(p<0.05)。(5)TGR5敲低能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步验证TGR5在成骨分化中的生物学功能,通过TGR5 siRNA转染敲除TGR5的表达。western blot证明TGR5敲除成功。重要的是,TGR5的沉默部分阻止了 ALP活性增加、基质矿化以及成骨细胞分化标记基因的表达,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。这些结果均提示TGR5可能在成骨分化中起重要作用。(6)TGR5通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化eNOS 的磷酸化和 AMP 活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)产生NO在成骨细胞分化过程中起关键作用。因此,我们检测了 GPBARA(3μM)是否能够影响MC3T3-E1eNOS/NO信号通路。结果发现:GPBARA(3μM)能够显著促进MC3T3-E1eNOS的磷酸化,且具有时间依赖性。DAF-FMDA染色用于检测MC3T3-E1NO的产生。结果表明,GPBARA处理将MC3T3-E1NO的产生时间从1h增加到6h。此外,我们还发现GPBARA(3μM)能够促进MC3T3-E1AMPK和ACC的磷酸化,且具有时间依赖。因此,我们推测TGR5通过激活AMPK信号通路促进MC3T3-E1向成骨细胞的分化。(7)AMPK抑制剂能够抑制MC3T3-E1向成骨细胞的分化为了进一步证实AMPK在调节GPBARA诱导的成骨分化作用中的作用,我们使用了特定的AMPK抑制剂化合物C来处理MC3T3-E1。利用条件性成骨培养基培养MC3T3-E1细胞,培养时间为14天。结果发现,复合物C的存在抑制了 GPBARA诱导的ALP活性升高、基质矿化和成骨细胞分化标记基因表达。同时我们还发现,使用复合物C阻断AMPK的活化,可以抑制GPBARA诱导的Runx-2表达。这些结果表明,TGR5在成骨分化中的作用是由AMPK介导的。(8)在骨骼形成过程中TGR5是成骨细胞分化必不可少的为了体内证明TGR5对小鼠骨骼发育和成骨细胞分化的影响,我们构建了 TGR5缺失的转基因小鼠,通过原位杂交分析TGR5的表达对骨骼形成的影响。结果发现:在E14.5,与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠ECM矿化的面积明显较少,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。Von Kossa染色用于检测骨骼中的钙含量以及ECM的矿化程度。与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中的钙含量更低,ECM的矿化程度更低,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。阿尔新蓝染色发现TGR5缺失的小鼠骨骼ECM中大部分为软骨一类细胞,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。此外,我们还发现与TGR5野生型小鼠相比,TGR5缺失的小鼠骨骼中成骨细胞分化的相关基因OCN、Col-Ⅰ的表达也显著降低,成骨细胞分化的转录因子Runx2的表达也显著降低,且差异均具有统计学意义(p<0.05)。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够影响骨骼中钙的沉积,调控成骨细胞分化相关基因的表达。(9)TGR5通过调控AMPK信号通路影响骨骼发育前面己经证明了 TGR5主要通过激活AMPK信号通路促进成骨细胞的分化,我们通过尾静脉注射的方式给TGR5缺失的小鼠给予AMPK激动剂GSK621(2mg/kg)注射,结果发现AMPK激动剂能够促进TGR5缺失小鼠骨骼的发育,也会促进成骨细胞分化相关基因OCN、Col-Ⅰ以及转录因子Runx2的表达。因此,在骨骼形成和发育过程中,TGR5能够通过AMPK信号通路影响骨骼的发育,调控成骨细胞分化相关基因的表达。结论总之,TGR5能够通过调控AMPK信号通路影响成骨细胞相关基因的表达,进而影响成骨细胞的分化和骨骼的发育。本研究不仅阐明了 TGR5在骨形成过程中的生理功能,为骨代谢的分子机制提供了新的见解,也为临床治疗骨相关疾病提供了新的理论基础和靶点。