血管是脊椎动物胚胎发育过程中最先形成的器官之一,有功能的血管系统对胚胎发育和成体生存都是不可或缺的。我们都知道血管发育过程可以分为两个阶段,血管发生(vasculogenesis)和血管生成(angiogenesis)。前者是胚胎发育过程中血管从无到有形成初级血管网络的过程,而后者则是在已有血管初级网络的基础上通过出芽的方式形成新的血管,直到有功能的完整的血管网络形成,这个过程包含了很多独立的过程参与。血管一旦出现缺陷其他器官的发育也会受到影响甚至还会导致严重的疾病发生,比如肿瘤。而目前血管类疾病的治疗也比较复杂,特别是脑血管疾病,脑血管海绵状畸形(CCMs)就是其中最典型的脑血管类疾病,CCMs也是斑马鱼作为研究血管疾病模型的典型案例,斑马鱼作为研究血管发育的理想模型已经很多年了,各种研究手段都已经很成熟,这是斑马鱼作为研究血管发育模型的巨大优势。利用斑马鱼进行ENU大规模诱变寻找影响血管发育的新基因,这是研究血管发育的一种有效手段。于是我们在斑马鱼中进行了ENU大规模诱变和筛选,我们找到了一种新的血管发育缺陷突变体,通过突变基因的定位与克隆我们确定了突变基因在斑马鱼中编码组氨酰tRNA合成酶(histidyl-tRNA synthetase,Hars)。Hars是20种氨酰-tRNA合成酶(Aminoacyl--tRNA synthetases,AARSs)之一,其经典功能是将游离的组氨酸加载到与其对应的tRNA上组装成组氨酰-tRNA,该过程是蛋白质合成的必需环节,该基因的经典功能实现了遗传密码从碱基到蛋白质的转变。但是,最近的研究发现,一些氨酰-tRNA合成酶随着进化过程的发生增加了许多新的生物学功能,包括免疫、炎症反应、血管发育等。目前关于这类基因的研究大多数都局限在体外,而且不同的AARSs发挥的新的生物学功能作用的器官也不尽相同。不同AARSs就算都是影响血管发育其作用机制也并不相同,有的是直接作为转录因子发挥功能,有的则是参与相关信号通路,还有的是参与相关基因的蛋白质合成。目前为止,具体有哪些氨酰tRNA合成酶在血管发育过程中发挥功能暂时还没有完全搞清楚,他们各自的作用的机制研究得也还不完全清楚。在本研究中,我们发现了Hars拥有调控斑马鱼血管发育的非经典功能。我们通过大规模正向遗传筛选突变体,筛选到一个新的斑马鱼血管发育缺陷的突变体,其在受精后48 h(hours post fertilization,hpf),头部血管和节间血管出芽增多、连接紊乱,血管出现异常过度分支,导致整个血管模式建成发生紊乱。而这些紊乱的血管主要是通过出芽的方式生长的,生长主要发生在受精后36 h,因此该突变体主要是影响了血管生成阶段。通过染色体定位和基因克隆,我们确定了导致该突变体血管缺陷表型的基因是hars,在斑马鱼中编码一种组氨酰-tRNA合成酶,其经典作用是将组氨酰加载到对应的tRNA上,该过程是生物体蛋白质合成的必须过程。为了探究蛋白质合成功能是否对突变体中血管出芽增多的表型有作用,我们用蛋白质合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide,CHX)抑制斑马鱼的蛋白质合成功能。结果抑制蛋白合成功能后并没有出现如突变体中的血管出芽增多类似的表型,反而是蛋白质合成受阻之后血管的发育也相应的受到了抑制。同时,我们也直接检测了突变体中的Hars的活性,发现突变体中氨酰化活性水平与野生型相比并没有受到影响,这说明突变体血管增多的表型并不是由于缺少了蛋白质合成经典功能所导致的,Hars存在调控血管发育的非经典功能。我们发现在突变体中血管内皮粘连蛋白(VE-cadherin,Cdh5)的表达上调,特别是在内皮细胞出芽增多,连接紊乱处内皮细胞的Cdh5分布也存在明显异常,另外内皮细胞的细胞极性相关蛋白(Podocalyxin,Pdxl2)也不规则的聚集在血管出芽增多、连接紊乱的位置,这暗示在突变体中内皮细胞的极性出现了错误。有研究表明Pdxl2等极性蛋白的准确定位对内皮细胞的生长以及血管腔的形成有重要作用,而Cdh5可以调控Pdxl2的分布。我们用morpholino敲降了cdh5的表达之后,头部血管连接紊乱的现象减少了,这说明突变体中内皮细胞连接紊乱是由cdh5介导的。同时,我们还在突变体中检测到的血管内皮生长因子A(vegfa)的表达也异常上调。Vegfa是血管生长所必需的生长因子,其重要功能在老鼠、斑马鱼以及其他物种中都已经得到了充分的证明。我们用Vegf信号通路受体抑制剂SU5416处理36 hpf的突变体胚胎,在突变体表型最明显的时候约60 hpf左右进行观察,我们发现用抑制剂处理后的突变体头部血管和节间血管的异常出芽缺陷都被回救了,这说明突变体中血管的生长受到了Vegfa的调控。除此之外,我们比对了斑马鱼的Hars和哺乳动物的HARS蛋白质序列,发现他们高度同源,并且用人类的HARS mRNA能够有效的回救斑马鱼hars突变体中血管的缺陷,这表明,斑马鱼和人类的HARS基因在调控血管发育方面的功能是高度保守的。最后,我们还检测到了HARS在人脐静脉内皮细胞(HUVECs)的细胞核中有大量表达,这暗示HARS可能作为一种新的转录因子直接调控相关基因的转录。综上所述,我们通过ENU筛选得到一种新的斑马鱼突变体,鉴定出其突变基因为hars,通过对突变体的研究,我们揭示了Hars具有调控血管发育的非经典功能,其非经典功能缺失将导致血管出芽异常增多、血管间连接紊乱,过度分支的血管表型。Hars的非经典功能是在血管发育过程中负调控cdh5和vegfa,抑制血管的过度分支和生长。该基因的非经典功能在斑马鱼和人类中保守,这暗示我们在人类中如果突变了该基因,可能会造成类似的血管缺陷疾病,斑马鱼中的突变体可以成为该类疾病的研究模型。