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肌醇磷酸神经酰胺合酶(Inositolphosphorylceramide synthase,IPCS)能够催化磷酸肌醇与神经酰胺生成肌醇磷酸神经酰胺,是植物鞘脂合成途径中的一种关键酶。植物IPCS家族基因在植物的生长发育和逆境适应中具有重要作用,有关植物IPCS家族基因的克隆、表达分析和功能的研究报道较少。水稻基因组中存在3个OsIPCS基因:Os IPCS1、OsIPCS2和OsIPCS3,到目前为止,对水稻OsIPCS家族基因的表达特性和基因功能的研究报道非常有限。本研究以粳稻中花11为材料,采用RT-PCR等方法克隆了3个水稻OsIPCS家族基因;通过生物信息学等方法分析了OsIPCS家族基因的序列特点、蛋白质保守结构域和系统发生树等;基于qRT-PCR等方法对正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同组织部位的表达特性进行了分析;利用pCXUN质粒构建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的过量和下调表达载体,以农杆菌介导法转化水稻,获得了OsIPCS2和OsIPCS3基因的过量和下调表达转基因植株;此外,还利用烟草叶片瞬时表达法对预测的OsIPCS蛋白进行了亚细胞定位分析,为进一步研究水稻OsIPCS家族基因的生物学功能奠定了基础。主要研究结果如下:1.水稻OsIPCS家族基因的生物信息学分析3个OsIPCS基因分布于第1和第5号染色体上,它们分别含有12到13个外显子。结合拟南芥、玉米和大豆等的IPSC基因序列分析发现:大多数植物IPCS基因都含有11个内含子,说明这可能是植物IPCS家族基因的保守特征。蛋白序列分析结果也表明,3个预测的水稻OsIPCS蛋白中均具有典型的植物IPCS家族蛋白特征,即具有高度保守结构域D3和D4。系统进化树分析结果表明大多数植物IPCS蛋白可以划分为单子叶组和双子叶组,Os IPCS1和OsIPCS2聚集在一个分支上而OsIPCS3位于另一分支上。对3个候选的水稻OsIPCS基因的启动子分析发现,3个基因有几种相同的顺式作用元件如ABRE、MBS、Skn-1_motif和circadian等,表明3个基因可能在植物的生长发育和外源激素以及非生物胁迫过程中发挥着重要作用。OsIPCS家族基因的启动子序列中也有响应生物胁迫的顺式作用元件,如OsIPCS3的启动子中有真菌诱导子响应元件Box_W1;OsIPCS1的启动子中有防御和应激反应性的TC-rich repeats。2.正常和逆境下OsIPCS家族基因在水稻不同组织部位的表达分析荧光定量表达分析结果表明,在正常生长情况下,3个候选的OsIPCS基因在水稻幼苗的根、茎、叶和孕穗期的幼穗中均有表达,说明OsIPCS基因可能在水稻生长发育过程中具有重要作用;并且3个OsIPCS基因在水稻不同组织部位中的表达量存在明显差异,其中OsIPCS1和OsIPCS2的表达量均为幼穗>叶>根>茎,OsIPCS3则为叶>幼穗>根>茎,说明OsIPCS基因在功能上可能存在不同。在低温、干旱和高盐等非生物胁迫下,3个OsIPCS基因的表达模式也存在明显的差异,例如低温胁迫下,OsIPCS1和OsIPCS2在水稻幼苗的根和茎中均显著上调表达,在叶中则下调表达;而OsIPCS3在水稻根、茎和叶中均显著上调表达;推测OsIPCS家族基因可能在水稻的逆境适应过程中也发挥着重要的作用,且3个OsIPCS基因可能存在功能上的分化。3.水稻OsIPCS2和OsIPCS3的过量和下调表达载体构建及遗传转化在利用RT-PCR等方法克隆了3个水稻OsIPCS家族基因的基础上,利用pCXUN分别构建了OsIPCS2和OsIPCS3基因的过量和下调表达载体,通过农杆菌介导法成功转化粳稻中花11,总计筛选和鉴定到了160个阳性T0代转基因水稻植株,目前已经鉴定获得了OsIPCS2和OsIPCS3的过量表达转基因T2代种子和下调表达转基因T1代种子。为进一步分析OsIPCS2和OsIPCS3基因在水稻生长发育和逆境适应中的生物学功能奠定了基础。4.水稻OsIPCS蛋白的亚细胞定位利用WoLF PSORT在线软件对3个OsIPCS蛋白的亚细胞定位情况进行预测,结果表明Os IPCS1在细胞溶质、内质网、线粒体、质膜和液泡中均有表达,OsIPCS2在细胞溶质、细胞溶质_细胞核、细胞核、质膜、内质网和液泡中均有表达,OsIPCS3在线粒体、线粒体_叶绿体、叶绿体和细胞质_线粒体中有表达。进而,我们构建了OsIPCS1和OsIPCS2蛋白与绿色荧光蛋白GFP的融合表达载体,烟草瞬时表达结果初步表明:Os IPCS2蛋白可能在细胞核、质膜和其他膜上均有明显表达;Os IPCS1蛋白可能在细胞核中表达,在质膜和其他膜上的表达较弱,有待进一步研究。