基于高通量芯片的食管鳞状细胞癌淋巴结转移相关环状RNA初步研究

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目的:食管癌是一种常见的胃肠道实体肿瘤,发病人数和死亡率均较高。其中,淋巴结转移是食管癌患者预后不良的重要因素之一,可作为食管癌的独立预后指标,指导食管癌的治疗决策。环状RNA(circRNAs)作为一种新型的非编码RNA,其异常表达在肿瘤的发生发展过程中发挥着重要作用。但目前对食管癌淋巴结转移相关的circRNAs表达谱进行筛选和验证的研究报道仍然较少。本实验分析了淋巴结转移和未淋巴结转移的食管癌的circRNAs表达谱特征,应用生物信息学方法寻找与食管癌淋巴结转移相关的circRNAs并进一步验证,旨在为及时发现食管癌淋巴结转移提供理论依据。方法:选择5例淋巴结转移和5例未淋巴结转移的食管癌患者的癌组织和配对正常组织。利用高通量芯片技术检测circRNAs的差异表达,初步建立与食管癌淋巴结转移相关的circRNA表达谱。GO分析和KEGG pathway分析可以阐明筛选出的circRNA的靶基因的功能。然后扩大样本量,从淋巴结转移的食管癌差异表达的circRNAs中随机选择4个进行q RT-PCR大样本验证。在Target Scan和mi Randa算法的基础上,使用Arraystar的miRNA靶点预测软件来预测miRNA作用位点,初步揭示可能作用的机制。进一步通过临床病理关系分析和Kaplan-Meier生存分析以探索差异表达基因与食管癌淋巴结转移预后的关系。结果:(1)利用高通量芯片技术,我们筛选并验证了食管癌淋巴结转移相关的circRNA。结果是,以差异表达倍数≥2,P≤0.05为标准,在淋巴结转移的食管癌样本中,共筛选出271个差异表达上调circRNAs,385个差异表达下调circRNAs。以同样的标准,在未淋巴结转移的食管癌样本中,共筛选出483个差异表达上调circRNAs,650个差异表达下调circRNAs。(2)进一步对差异表达的circRNAs的亲本基因进行GO分析和KEGG途径分析,结果显示:在淋巴结转移的食管癌中,差异上调的circRNAs的亲本基因富集较多的生物过程、分子功能、细胞组分分别是细胞器组织[GO:0006996]、蛋白结合[GO:0005515]、细胞内细胞器[GO:0043229];差异下调的circRNAs的亲本基因富集较多的生物过程、分子功能、细胞组分分别是参与分化的细胞形态发生[GO:0000904]、细胞骨架蛋白结合[GO:0008092]、细胞骨架[GO:0005856]。Pathway分析结果显示:在淋巴结转移的的食管癌中,差异表达上调的circRNAs的亲本基因参与的相关通路主要包括细胞周期、FcγR介导的吞噬作用等;差异表达下调的circRNAs的亲本基因参与的通路主要包括血管平滑肌收缩、黏着斑等。(3)从淋巴结转移的食管癌差异表达circRNAs中随机选择4个(1个上调circRNA_057090和3个下调的circRNA_001640、circRNA_103777及circRNA_406549)进行q RT-PCR验证,结果显示这四个分子表达水平与芯片表达趋势一致。Arraystar的miRNA靶点预测结果显示,circRNA_057090、circRNA_001640、circRNA_103777和circRNA_406549上存在多个miRNAs结合位点。(4)circRNA_001640、circRNA_103777、circRNA_406549低表达与患者淋巴结转移和TNM分期显著相关,且低表达的患者预后更差;而circRNA_057090高表达与患者淋巴结转移和TNM分期显著相关,且高表达的患者预后更差。结论:本研究在高通量芯片的基础上初步筛选并构建了食管癌淋巴结转移相关circRNAs表达谱。选取circRNA_057090、circRNA_001640、circRNA_103777和circRNA_406549通过q RT-PCR初步验证了芯片结果,并预测了这些circRNAs包含多个miRNA结合位点,从而证实了这些circRNAs可能在食管癌淋巴结转移中发挥了重要功能。
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