【摘 要】
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巴卡亭Ⅲ是抗癌药物紫杉醇生物合成途径中重要的前体物质,主要通过10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10-β-O-乙酰转移酶（DABT）催化乙酰辅酶A（acetyl-Co A）和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）生成的。但是,常见研究中红豆杉来源的DBAT酶活力相对较低,因此,寻找可催化乙酰基转移反应的替代基因是必要的。本研究从平菇中克隆了高丝氨酸O-乙酰基转移酶基因和麦芽糖O-乙酰基转移酶基因,并进行了原核表
【基金项目】
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广东省科技计划金项目（粤港联合创新领域 2014B050505018）； 广东省现代农业产业体系岗位专家（2017LM1125,2017LM1126）；
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巴卡亭Ⅲ是抗癌药物紫杉醇生物合成途径中重要的前体物质,主要通过10-去乙酰巴卡亭Ⅲ10-β-O-乙酰转移酶（DABT）催化乙酰辅酶A（acetyl-Co A）和10-去乙酰基巴卡亭Ⅲ（10-DAB）生成的。但是,常见研究中红豆杉来源的DBAT酶活力相对较低,因此,寻找可催化乙酰基转移反应的替代基因是必要的。本研究从平菇中克隆了高丝氨酸O-乙酰基转移酶基因和麦芽糖O-乙酰基转移酶基因,并进行了原核表达,同时对高丝氨酸O-乙酰基转移酶P1-HTA进行模拟DBAT的分子对接改造,对其可否替代DBAT生成巴卡亭Ⅲ进行了探究。主要研究结果如下:（1）提取平菇菌丝球总RNA作为模板,通过反转录PCR克隆获得了两个高丝氨酸O-乙酰基转移酶基因（p1-hta、p2-hta1）和一个麦芽糖O-乙酰基转移酶基因（p-mta1）。（2）p1-hta基因诱导表达。利用酶切连接法构建含p1-hta基因的表达载体p ET32a-p1-hta,并转化至大肠杆菌BL21。SDS-PAGE分析表明,IPTG终浓度为0.2 m M,诱导温度为25℃,诱导时间为16 h时,工程菌BL21/p ET32a-p1-hta的可溶性P1-HTA蛋白表达量最高。将表达载体p ET32a-p1-hta和p ET22b-p1-hta分别转入大肠杆菌Rosetta、Origami B和Rosetta gami plys S,以BL21/p ET32a-p1-hta为参照,探究该酶在不同载体及宿主组合中的表达情况,结果表明,工程菌BL21/p ET32a-p1-hta、Rosetta/p ET32a-p1-hta和Origami B/p ET32a-p1-hta诱导表达的可溶性P1-HTA蛋白含量较高。（3）以高丝氨酸为底物,对P1-HTA、P2-HTA1和P2-HTA进行酶活检测并分别测定了它们的酶学性质,结果表明P1-HTA的比活力为15.323±0.183 m U·mg-1,Km为0.087±0.033μM,kcat/Km为19.828;P2-HTA1的比活力为9.839±0.029 m U·mg-1,Km为0.125±0.037μM,kcat/Km为13.488;P2-HTA的比活力为10.034±0.012 m U·mg-1,Km为0.117±0.012μM,kcat/Km为15.786。以10-DAB和acetyl-Co A为底物,探索P1-HTA、P2-HTA1、P2-HTA、P-MTA1和P-MTA的催化活性,结果表明,这5种酶均不能替代DBAT催化10-DAB和acetyl-Co A生成巴卡亭Ⅲ。（4）利用分子对接模拟,将10-DAB在DBAT中的底物结合口袋替换到了P1-HTA中相应的活性口袋中,得到突变酶P1-HTA-MUT。以高丝氨酸为底物,对突变酶P1-HTA-MUT进行酶活检测并测定了其酶学性质。结果表明,P1-HTA-MUT的比活力为20.925±0.033 m U·mg-1,相比野生型P1-HTA提高了约1.4倍;P1-HTA-MUT的Km为0.076±0.008μM,相比野生型P1-HTA,底物与酶的亲和力增加了约0.011μM;P1-HTA-MUT的kcat/Km为28.737,相比野生型P1-HTA,酶的催化效率提高了约1.4倍。以10-DAB和acetyl-Co A为底物,探索突变酶P1-HTA-MUT的催化活性,结果表明,P1-HTA-MUT不能替代DBAT催化10-DAB和acetyl-Co A生成巴卡亭Ⅲ。本研究中,突变酶P1-HTA-MUT无法替代DBAT催化10-DAB和acetyl-Co A生成巴卡亭Ⅲ,表明整个活性口袋的单一替换不能改变酶的底物特异性。在进行突变改造时,还需要考虑静电相互作用、氢键、疏水相互作用及空间位阻效应等多种因素的影响。另一方面,P1-HTA-MUT催化高丝氨酸和acetyl-Co A生成O-乙酰高丝氨酸的酶活性提高,而高丝氨酸O-乙酰基转移酶又是生物合成蛋氨酸中重要的酶。因此,该底物口袋替换结果可为蛋氨酸的合成研究提供参考。
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