虫媒病毒(arbovirus)是指通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而引起的自然疫源性疾病及人兽共患病的一组病毒。主要集中在披膜病毒科甲病毒属、黄病毒科黄病毒属和布尼亚病毒科,如披膜病毒科甲属病毒属的基孔肯尼亚病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、罗斯河病毒、委内瑞拉马脑炎病毒;黄病毒科黄病毒属的登革病毒、西尼罗病毒、圣路易斯脑炎病毒;布尼亚病毒科加利福尼亚脑炎血清组病毒,塔希纳病毒。昆虫通过叮咬将病毒传播给人、畜引起疾病,不但造成人类疾病和死亡,更会造成大批牲畜发病甚至死亡,造成巨大经济损失,成为各国的公共卫生问题。虫媒病毒为全世界分布,但主要分布于中温带、亚热带和热带。大多数虫媒病毒只分布于一个地区或一个洲,但可随人群的流动、宿主和媒介的迁移而传播到异地。因此我们应加强入境医学媒介携带虫媒病毒的检测。目前,虫媒病毒的检测主要有病毒分离、血清学及分子生物学方法,但上述几种方法都有各自的不足之处。病毒分离法虽是金标准,但因其技术难度大,周期长,在实际工作中难以推广应用。血清学的酶联免疫吸附试验(ELISA)检测法,目前用于虫媒病毒检测的商品化试剂数量少,对于尚未传入我国的虫媒病毒则没有相应检测试剂。而常规RT-PCR对于未知病原体的检测需要几个甚至几十个PCR反应才能对未知病原做出鉴定。本研究利用TaqMan探针法荧光定量RT-PCR技术,建立快速、敏感、高通量的检测虫媒病毒的方法,应用于国境口岸虫媒病毒的监测、检测。目的:本研究拟开展虫媒病毒,尤其是入境医学媒介携带虫媒病毒的荧光定量RT-PCR检测技术研究,建立一种同时检测甲病毒属、黄病毒属及正布尼亚病毒属的多重荧光定量RT-PCR的检测方法,并应用于国境口岸蚊虫携带虫媒病毒的检测。方法:从GenBank中检索甲病毒属、黄病毒属和正布尼亚病毒属代表株的全基因序列,通过DNAstar进行序列比对和Blast进行保守序列搜索和分析;用Beacon Designer 7.0软件分别设计甲病毒属、黄病毒属和正布尼亚病毒属通用引物和探针;以体外转录的甲病毒属盖塔病毒mRNA、黄病毒属乙脑病毒RNA和正布尼亚病毒属塔希纳病毒RNA为模板,分别建立甲病毒属、黄病毒属和正布尼亚病毒属TaqMan探针单重荧光定量RT-PCR,甲病毒属黄病毒属TaqMan探针双重荧光定量RT-PCR方法及甲病毒属、黄病毒属和正布尼亚病毒属TaqMan探针多重荧光定量RT-PCR;并应用于现场蚊虫标本携带虫媒病毒的检测。结果:①建立的甲病毒属荧光定量RT-PCR方法,具有很好的特异性和灵敏性,对盖塔病毒RNA的敏感性为2.9×103copies/μL,基孔肯雅病毒1.74×103copies/μL。与黄病毒属乙脑病毒、黄热病毒、登革病毒,正布尼亚病毒属的塔希纳病毒及东南亚十二节段RNA病毒属的版纳病毒均无交叉反应。②建立的黄病毒属荧光定量RT-PCR方法,具有很好的特异性和灵敏性,对乙脑病毒RNA的敏感性为1.3×103 copies/μL,黄热病毒6.6×102copies/μL,登革病毒敏感性约为 9.68×102～1.46×103copies/μL。与盖塔病毒、版纳病毒均没有交叉反应。③建立的正布尼亚病毒属荧光定量RT-PCR方法,对塔希纳病毒RNA的敏感性为5.76×102copies/μL;与黄病毒属乙脑病毒、黄热病毒、登革病毒,甲病毒属盖塔病毒、基孔肯雅病毒及东南亚十二节段RNA病毒属的版纳病毒均无交叉反应。④建立的甲病毒属、黄病毒属双重荧光定量RT-PCR方法,乙脑病毒敏感性为1.3×103 copies/μL,盖塔病毒敏感性为2.9×103copies/μL;与塔希纳病毒及版纳病毒均无交叉反应。⑤建立的甲病毒属、黄病毒属及正布尼亚病毒属多重荧光定量RT-PCR方法,盖塔病毒RNA的敏感性为2.9×103 copies/μL,乙脑病毒RNA敏感性为1.3×103copies/μL,塔希纳病毒RNA的敏感性为5.76×10copies/μL,检测敏感性与单重体系相同,并且具有很好的特异性。用本实验所建立的TaqMan探针荧光定量方法检测2009年云南边境蚊虫标本201份,结果8份标本结果判断为黄病毒属阳性,这8份标本均导致BHK-21细胞产生规律病变,病变细胞上清经RT-PCR扩增、测序,与乙脑病毒毒株的同源性均在98%以上,证实为乙脑病毒。结论:建立了甲病毒属、黄病毒属和正布尼亚病毒属的多重TaqMan探针荧光定量RT-PCR方法,对于口岸蚊传虫媒病毒检测具有广泛应用价值。