雌激素受体的微流控芯片免疫电泳检测方法研究

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雌激素长期过度刺激,雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)表达水平增高,是导致乳腺癌的一个重要原因。因此ER在乳腺癌发生发展过程中扮演重要角色。乳腺癌作为雌激素依赖性肿瘤,雌激素与ER相互作用并参与乳腺癌的发生、发展。ER表达水平的高低与乳腺癌的诊断、治疗以及预后密切相关。乳腺癌细胞中ER主要以ERα为主,传统方法如免疫组化,只能测定ERα的相对水平,不能对ERα做精确定量分析。因此有必要深入研究建立ERα定量分析方法。论文以自行搭建的微流控芯片免疫电泳分析仪和高灵敏度激光诱导荧光检测器为基础,采用电动操纵法实现了人乳腺癌MCF-7细胞中ERα含量的精确定量。其优点是:特异性强、用量少,可以实现nL级进样;简单;快速;易于实现。论文主要包括四个部分,内容如下:第一章绪论对ERα的结构以及ERα检测的意义,微流控芯片免疫电泳的基本概念以及芯片的制作和修饰方法进行了概述。主要对当前ERα的检测方法,以及当前微流控芯片免疫电泳检测方法的研究进展进行综述。第二章建立了一种基于微流控芯片免疫电泳-激光诱导荧光检测系统测定MCF-7中ERα含量的分析方法。该方法首先利用自行合成的anti-ERα-FITC与ERα标准样品反应。将反应后的产物置于石英玻璃材料制作的微流控芯片储液池中,利用激光诱导荧光检测系统,通过详细的优化电泳电压及缓冲液条件,实现了ERα-anti-ERα-FITC与anti-ERα-FITC的有效分离。建立了ERα标准样品的浓度与反应前后anti-ERα-FITC峰面积变化量的标准曲线,得到线性方程:y=9.226+0.176x,R2=0.9857。测定ERα的线性范围为1.880×10-92.268×10-7mol/L,最低检出限:9.400×10-10mol/L。第三章利用微流控芯片免疫电泳-激光诱导荧光检测系统,实现了对MCF-7细胞匀浆中ERα含量的测定。根据建立的标准曲线,当细胞密度为1.450×107个/mL时,得到MCF-7细胞匀浆中ERα的含量为2.857×10-7mol/L。第四章利用ELISA方法,对基于微流控芯片免疫电泳-激光诱导荧光检测系统测定MCF-7细胞匀浆中ERα含量的可行性进行了验证。利用ELISA方法建立标准曲线得到线性方程:y=-0.03737+0.01037x,R2=0.9915。最低检测限:9.400×10-11mol/L,线性范围:9.400×10-101.880×10-7mol/L。当细胞密度为1.450×107个/mL时,得到MCF-7细胞匀浆中ERα的含量为1.183×10-7mol/L。与微流控芯片免疫电泳测得的MCF-7细胞匀浆中ERα的含量基本吻合。从而证明了基于微流控芯片免疫电泳-激光诱导荧光检测系统测定MCF-7细胞匀浆中ERα含量的可行性。第五章对利用ERα-mRNA纳米火焰探针对单个MCF-7细胞中ERα-mRNA的分析检测进行了初步的探索实验,优化了进样时细胞密度大约为104个/mL时,初步确定了检测时激发波长为532nm。ERα-mRNA的含量直接反映ERα的含量从而实现对MCF-7细胞中ERα的测定。
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