【摘 要】
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牛结核病是家畜的一种慢性传染病且能传染给人,人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因之一.以罗氏培养法培养牛型结核杆菌Vallee株,应用硫氰酸胍裂解法提取结
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牛结核病是家畜的一种慢性传染病且能传染给人,人畜结核病的交叉传播是造成结核病广泛流行的重要原因之一.以罗氏培养法培养牛型结核杆菌Vallee株,应用硫氰酸胍裂解法提取结核杆菌DNA,并以此作为PCR扩增的模板.应用oligo6.0软件分别设计牛分枝杆菌ESAT-6、CFP10和MPB83基因的引物,上游引物均含BamHI酶切位点,下游引物均含EcoRI酶切位点.以牛型分枝杆菌Vallee株基因组DNA为模板,应用PCR方法分别扩增ESAT-6、CFP10和MPB83基因,PCR产物经DNA纯化试剂盒纯化后与载体PMD18-T连接,连接产物转化于JM83感受态细胞中,涂布于含氨卞青霉素的LB平板上,挑取白色菌落接种于5ml含氨卞青霉素LB的液体培养基中,小量法提取质粒DNA,重组质粒经BamHI/EcoRI进行酶切鉴定.重组质粒分别命名为ESAT-6-T、CFP10-T和MPB83-T.重组质粒ESAT-6-T、CFP10-T和MPB83-T经BamHI/EcoRI进行酶切后,分别回收ESAT-6、CFP10和MPB83基因,亚克隆到原核表达载体PGEX-6P-1上,构建原核重组表达质粒ESAT-6-PGEX、CFP10-PGEX和MPB83-PGEX,转化入大肠杆菌BL21中.以1mmol/l IPTG诱导,进行SDS-PAGE电泳.结果表明,ESAT-6、CFP10和MPB83基因表达的GST融合蛋白相对分子量分别为32KD、36KD和48KD,与实测相符.表达量分别为16.5％、20.6%和38.2%.用同样在大肠杆菌中表达的分泌性MPB70融合蛋白进行ELISA试验以确定抗原最佳包被浓度和一抗二抗的最佳稀释倍数.重组结核杆菌分泌蛋白ESAT-6、CFP10和MPB83的成功表达及基于MPB70抗原的ELISA试验为结核病诊断及重组疫苗的构建打下基础.
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