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背景:液体活检是对体液当中的循环肿瘤细胞（Circulating tumor cells,CTCs）、循环肿瘤DNA和RNA以及外泌体等肿瘤相关物质进行检测的方法。液体活检具有创伤小,成本低,可重复采样和实现实时检测的优点。CTCs由于经历上皮-间质转化或者外界刺激（例如诊疗操作）而从原位瘤或者转移灶脱落,经血液和淋巴循环系统入侵和定殖到其他部位的组织和器官并大量地增殖,从而导致了肿瘤的转移和复发。对CTCs的检测可以辅助早期诊断乳腺癌、肺癌和结直肠癌等多种肿瘤。CTCs检测还可以帮助判断预后,监测肿瘤的发展过程和药物治疗效果以及制定个性化的治疗方案。同时CTCs本身也可以作为肿瘤治疗的靶标。由于CTCs在血液当中的含量极少且存在异质性的问题,因此给CTCs的检测带来了很大的挑战。目前,包括流式细胞术和免疫荧光在内的多种检测技术被运用到CTCs的检测当中。但是上述方法都不同程度地存在操作复杂、耗时长和依赖于精密仪器等问题。因此迫切需要建立一种高灵敏度、高特异度、快速、简便且成本低的检测方法。生物传感器由于具有体积小、使用成本低、操作简便和灵敏度高的特点已经成为医学领域的研究热点。依托电化学生物传感器,研究人员实现了对蛋白、细胞、细菌、病毒和小分子物质等生物样本的痕量检测。适配体是一段含有20-100个碱基的DNA或者RNA序列,通过形成发夹、假结和G-四聚体等特定的空间结构而与靶标特异性地识别和结合。适配体是除了抗体以外理想的能够与靶标结合的生物探针,被形象地喻为“化学抗体”。适配体具有亲和力高,易于合成和修饰,稳定性好,没有毒性且免疫原性小甚至没有的优点,因此适合用于靶细胞的识别和捕获。等温扩增技术例如滚环扩增反应（Rolling circle amplification,RCA）可以在恒定的温度下将核酸链进行指数级延长,具有设计方便和扩增效率高的特点,可以用于信号扩增以达到提高生物传感器检测灵敏度的目的。因此我们以K562细胞为靶标,用一条适配体作为捕获探针,另一条适配体作为信号探针。将信号探针与RCA结合以实现信号放大并标记到靶细胞上,同时利用捕获探针特异性捕获靶细胞的策略构建了一种新型的双适配体夹心识别型电化学生物传感器并用于CTCs的检测。另一方面,为了提高检测的性能,越来越多的纳米材料被运用到生物传感器上。其中金属纳米颗粒例如金纳米颗粒（Au nanoparticles,Au NPs）具有生物相容性好、导电性高、活性面积大和具有催化活性的特点。因此,为了实现更简便高效的CTCs检测,我们将Au NPs修饰到生物传感器的反应界面上通过增加反应界面的活性面积来固定更多的适配体。基于适配体和靶细胞的特异性识别和结合导致杂交双链构象改变从而引起信号输出的策略,我们建立了一种非标记的高灵敏检测CTCs的方法。目的:1、通过双适配体夹心识别及RCA放大电化学信号的策略构建一种新型的电化学生物传感器,实现CTCs的高灵敏和高特异检测,为肿瘤的早期诊断和治疗提供帮助。2、通过适配体和靶细胞的高亲和力及Au NPs扩大生物传感器反应界面活性面积的策略构建一种非标记“signal-off”适配体型电化学生物传感器,实现高特异和高灵敏的CTCs检测,为肿瘤的早期诊断和预后判断提供一种无创的检查方法。方法:1、基于双适配体夹心识别及RCA的电化学生物传感技术的建立及用于CTCs检测的研究⑴对随机序列和两条适配体进行荧光标记后分别与K562细胞共孵育,然后采用流式细胞仪进行检测。考察荧光强度的变化情况,验证适配体与K562细胞结合的特异性。⑵将一条适配体进行荧光标记后与过量的另一条非标记适配体以及K562细胞共孵育,然后用流式细胞仪进行检测。通过分析荧光强度的变化情况来考察两条适配体与K562细胞结合位点的差异,为下一步构建基于双适配体夹心识别的检测平台提供依据。⑶通过聚丙烯酰胺凝胶电泳验证RCA的效果。⑷通过循环伏安法和电阻抗法验证电极表面的修饰过程。⑸对组装在生物传感器上的捕获探针浓度,捕获探针与K562细胞的反应时间和温度,以及信号探针与K562细胞的反应时间和温度等关键反应条件进行优化,以期获得该型生物传感器的最佳检测性能。⑹在最优的检测条件下对该型生物传感器的检测性能进行分析。得到生物传感器检测K562细胞的线性方程式、线性范围和最低检测限等指标。⑺在最优的检测条件下分别检测不同类别的肿瘤细胞以考察生物传感器的特异性。采用同一批次的电极检测K562细胞以考察生物传感器的重现性。保存一批组装好的电极,每7天取一组电极检测K562细胞以考察生物传感器的稳定性。⑻利用健康人群的血清来模拟临床样本,采用回收实验对生物传感器检测K562细胞的临床应用潜力进行初步探索。⑼利用特异性酶降解适配体,将生物传感器上捕获的K562细胞进行回收并继续培养。观察一周内K562细胞的生长情况,初步评价K562细胞用于后续研究的可行性。2、基于非标记“signal-off”适配体型电化学生物传感的CTCs检测技术的建立⑴将荧光标记的适配体和随机序列分别与K562细胞共孵育后采用流式细胞仪进行检测。比较荧光强度的变化情况,验证适配体与K562细胞结合的特异性。⑵采用FE-SEM、AFM和EDS对修饰后电极的二维形貌、三维形貌和元素含量进行分析,验证Au NPs和杂交双链是否成功修饰到电极上。⑶通过比较裸金电极和Au NPs修饰电极的活性面积来验证Au NPs增加生物传感器反应界面活性面积的效果。⑷通过循环伏安法和电阻抗法验证非标记“signal-off”适配体型电化学生物传感器的构建过程。⑸对亚甲蓝修饰的适配体浓度,生物传感器与K562细胞的反应时间和温度这三个关键的反应条件进行优化,以期得到最优的生物传感器检测性能。⑹在最优的检测条件下得到生物传感器检测K562细胞的线性方程式、线性范围和最低检测限等指标。⑺在最优的检测条件下分别检测对照肿瘤细胞以及PBS、FBS和BSA等干扰物质以分析生物传感器检测K562细胞的特异性。采用同一批次的电极检测K562细胞以分析生物传感器的重现性。保存一批组装好的电极,每6天取一组电极检测K562细胞来分析生物传感器的稳定性。⑻利用健康人群的血清模拟临床样本,通过回收实验初步探讨生物传感器的临床应用潜力。结果:1、成功构建了基于双适配体夹心识别及RCA的电化学生物传感器。探讨了该双适配体夹心型电化学生物传感器检测K562细胞的最佳条件。该生物传感器检测的线性范围为1×102–1×105 cells/m L,最低检测限为25 cells/m L。同时该生物传感器的特异性、重现性和稳定性好且对细胞的损伤较小。另外,回收试验显示该生物传感器具有临床应用的潜力。2、成功构建了非标记“signal-off”适配体型电化学生物传感器。优化了该非标记型电化学生物传感器检测K562细胞的实验条件。该生物传感器检测的线性范围为1×102–1×106 cells/m L,最低检测限为23 cells/m L。同时该生物传感器具有较好的特异性、重现性和稳定性。另外,采用临床模拟样本考察该型生物传感器的检测性能显示其具有临床应用的可能性。结论:1、基于双适配体夹心识别及RCA的电化学生物传感器的成功构建实现了CTCs的高灵敏检测。该方法为搭建基于不同CTCs的通用型生物传感器平台提供了一种思路,有助于肿瘤的早期诊断和治疗。2、非标记“signal-off”适配体型电化学生物传感器将纳米技术和临床检验诊断方法有效地结合起来,实现了CTCs的高灵敏检测。同时检测的线性范围更宽,检测过程更简便,检测时间更短,为肿瘤的早期诊断提供了一种无创的检测方法。