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由禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)引起的小麦赤霉病(Fusarium head blight),是我国长江中下游地区、华南冬麦区及黑龙江春麦区小麦生产上的重要病害。禾谷镰刀菌亚洲种(Fusarium asiaticum)是我国小麦赤霉病的优势致病种群。赤霉病不仅降低作物产量和品质,还产生多种有害真菌毒素,影响食品安全及人畜健康。化学防治一直是小麦赤霉病防治的主要方法,而长期施用单一化学杀菌剂,已经出现了抗药性致病菌。因此,开展禾谷镰刀菌新型杀菌剂靶点的基础研究,对于发展高效禾谷镰刀菌杀菌剂、促进小麦生产具有重要意义。细胞壁是真菌发育和致病的关键结构,几丁质是真菌细胞壁的重要结构性组成成分,但植物组织中不含有几丁质,因此催化合成几丁质的几丁质合成酶是发展新型杀菌剂的理想靶标。系统研究禾谷镰刀菌几丁质合成酶基因族不同基因的功能,可以为研发新型杀菌剂、发展赤霉病防治新措施提供理论依据。本研究以我国禾谷镰刀菌亚洲种代表性菌株5035为材料,利用分子生物学、微生物学、植物病理学及细胞生物学的方法和技术,构建了该菌株几丁质合成酶基因族单基因缺失突变体,分析比较了突变体菌株与野生型菌株在几丁质合成酶活性、几丁质含量、致病力、细胞壁超微结构、生长发育特征等方面的差异。所获得的主要研究结果如下：1.禾谷镰刀菌亚洲种基因组含有8个几丁质合成酶基因,根据它们所编码的氨基酸序列的同源性,这些基因分别属于7个不同的类型,分别是CHS1 (classⅠ), CHS2 (classⅡ), CHS3a (classⅢ), CHS3b (classⅢ), CHS4 (classⅣ), CHS5 (classⅤ), CHS6 (classⅥ)和CHS7 (classⅦ).除CHS7基因之外,其余7个几丁质合成酶基因全部用于功能鉴定。2.构建了7个几丁质合成酶基因同源重组载体,获得了6个(除CHS3b外)单基因缺失突变体,并经PCR、Southern、RT-PCR等多种方法检测验证。CHS3b基因未能得到相应的单基因缺失突变体,推测该基因的功能失活有致死效应。3.Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株的几丁质合成酶活性、几丁质含量、产孢能力等均比野生型菌株显著降低。上述3个突变体菌株的几丁质合成酶活性比野生型菌株分别降低了58%、53%、78%。在PDB培养条件下,Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株的几丁质含量分别降低了35%、19%、42%；在含有1.2 mol/L山梨醇的PDB培养条件下,3个突变体菌株的几丁质含量分别降低了23%、16%、37%；在含有1.2mol/L NaCl的PDB培养条件下,3个突变体菌株的几丁质含量分别降低了50%、30%、52%；这3个突变体菌株的分生孢子的几丁质含量也分别比野生型菌株降低了25%、41%、67%。在CMC培养条件下,Δchs1、Δchs2突变体菌株的产孢能力分别下降了22%和37%,Δchs5突变体则完全失去了产生分生孢子的能力；在含有20% PEG4000的CMC培养基中,Δchs1、Δchs2突变体菌株的产孢能力分别下降了30%和44%,Δchs5突变体则恢复了33%的产孢能力。Δchs3a、Δchs4、Δchs6突变体菌株在上述各方面均与野生型菌株没有显著差异。4.Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株对山梨醇、NaCl、SDS、H2O2、HCl等渗透压调节剂和杀菌剂的敏感性增强,菌丝生长和扩展受到抑制,各菌株能够分泌更多的色素物质到胞外。细胞核荧光染色观察结果显示,Δchs1、Δchs5突变体菌株平均每个菌丝细胞所含有的细胞核数目显著多于野生型菌株。Δchs5突变体菌株菌丝生长发育严重畸形,菌丝尖端和中间部位出现类似气球状的结构。透射电镜观察结果显示,Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株分生孢子、子囊孢子和菌丝的细胞壁结构均发生显著变化,细胞壁内层电子密度降低,细胞壁分层不明显；而Δchs3a、Δchs4、Δchs6突变体菌株与野生型菌株在上述各方面均没有观察到显著差异。5.Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株的致病力均显著降低。在苏麦3号田间花期单花接种后21 d,Δchs1、Δchs2、Δchs5突变体菌株的病小穗率分别比野生型菌株5035下降了40%、35%、57%；在安农8455田间花期单花接种后21 d,这3个突变体菌株的病小穗率分别下降了60%、50%、86%；室内苗期胚芽鞘接种后7 d,这3个突变体菌株的病斑长度分别下降了30%、42%、48%。6. CHSIC、CHS2C、CHS5C回复突变体菌株的几丁质合成酶活性与各自相应的单基因缺失突变体菌株相比分别增强了73%、94%、25%,其它性状也得到一定程度的功能恢复。7.建立了高效的根癌农杆菌介导转化禾谷镰刀菌的技术体系,T-DNA与目的基因间同源重组率达到100%,没有T-DNA多拷贝插入和异位插入现象。本研究结果表明,CHS1、CHS2、CHS5基因编码的是禾谷镰刀菌亚洲种几丁质生物合成的关键酶,它们在该菌生长发育及致病过程中具有关键作用,因而可作为杀菌剂研发的理想靶点；同时几丁质也可以作为控制该菌的靶标。这些研究结果为进一步研发新型赤霉病防治措施提供了依据和资料,对小麦赤霉病防治十分有意义。