【摘 要】
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乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,蛋白质乙酰化在原核生物和真核生物均广泛存在。近年来,利用高分辨率质谱结合免疫沉淀技术,已在细菌中发现了越来越多的乙酰化蛋白,如在
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乙酰化是一种重要的蛋白质翻译后修饰,蛋白质乙酰化在原核生物和真核生物均广泛存在。近年来,利用高分辨率质谱结合免疫沉淀技术,已在细菌中发现了越来越多的乙酰化蛋白,如在大肠杆菌中已发现乙酰化蛋白质Acs和K609乙酰化位点。与大量的乙酰化事件所对应的是在大肠杆菌中仅有CobB这一个去乙酰化酶。我们实验室利用Clip-chip技术结合大肠杆菌蛋白质芯片发现YcgC是一个新的去乙酰化酶,该酶与CobB差异较大。本研究的目的是进行YcgC的全局性底物发现研究,同CobB进行比较,从而进一步的对其功能进行揭示。 本研究利用SILAC技术整体标记蛋白质,基于高通量质谱全局性地发现CobB和YcgC的底物,并对其底物进行生物信息学的分析和体外验证。分别构建了YcgC和CobB的过表达菌株,同时利用Red重组技术构建了YcgC和CobB的敲除菌株。优化葡萄糖浓度和YcgC的诱导时间,使YcgC过表达菌株和野生型菌株整体的乙酰化差异最大。采用细胞稳定同位素标记策略,13C标记赖氨酸,利用泛乙酰化抗体免疫沉淀结合高分辨率的定量质谱,定量找到YcgC和CobB的去乙酰化底物。用体外纯化的YcgC作用于大肠杆菌蛋白质芯片,寻找与YcgC直接相互作用的蛋白。基于定量质谱和蛋白质芯片得到的大量的数据,进行生物信息学分析。根据芯片信号的强弱和归一化后质谱的结果挑选一系列底物进行体外去乙酰化反应的验证。YcgC主要底物有7个,分别为rfaQ,trmD,rfbC,narH,frdA,nusB,hisJ,与已报道的CobB的9个底物没有重合,表明这两种酶底物差异性大;和YcgC相互作用强并且是其底物的蛋白为panC,ydaL。
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