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茄科糖酯（又称酰基糖）在腺毛中特异合成,其不但具有抑菌、抗虫、抗微生物、抗氧化等多种生物功能,而且在烟草中也是重要香气前体物,对烟草香气品质具有重要贡献,因此,挖掘鉴定糖酯合成基因,揭示糖酯合成调控分子机制,对以提高糖酯含量为重要育种目标的茄科作物育种以及糖酯的生物合成利用,均具有重要意义。近年来,有关茄科糖酯合成过程中酰基链与糖环的组装及其关键调控基因的研究,在番茄和矮牵牛中已经取得较大进展。关于酰基链的形成机制,以往研究认为是通过支链氨基酸合成途径合成,但目前鉴定获得的关键调控基因还较少。本研究基于同源比对分析,挖掘支链氨基酸合成代谢的关键调控基因乙酰乳酸合酶基因3个,结合烟草腺毛和叶片转录组测序数据以及组织表达模式分析,发现其中一个乙酰乳酸合酶基因（定名NtALS1）在腺毛特异表达,推测其可能参与烟草糖酯合成。本研究通过组织定位、亚细胞定位和CRISPR Cas9敲除技术,对该基因进行了系统的功能鉴定。研究结果表明,NtALS1在腺毛腺头细胞的叶绿体中特异表达,是烟草糖酯合成代谢的一个关键基因。主要研究结果如下:1.从茄科基因组网的K326基因组中搜索到3个ALS大亚基的同源基因（定名NtALS1、NtALS2和NtALS3）,利用qRT-PCR分析了其在烤烟品种红花大金元不同组织的表达状况。结果表明,NtALS1在腺毛中特异高表达,NtALS2在7个组织均有表达,NtALS3几乎不表达。又将茄科基因组网搜索的茄科其他同源ALS构建系统进化树,并通过基因克隆分析NtALS1的遗传来源。结果表明,NtALS1来源于祖先种绒毛烟草,与其聚为一类的同源ALS,对应物种均含有糖酯,可能在腺毛中特异表达,而不含糖酯的林烟草Nisyl-mRNA-72505与NtALS2、NtALS3聚为一类。2.克隆了红花大金元的NtALS1启动子（定名NtALS1-P）,并构建NtALS1-P驱动GFP表达的组织定位载体,以本氏烟草为受体,进行农杆菌侵染和瞬时表达,利用激光共聚焦显微镜采集荧光信号。结果表明,GFP信号仅在本氏烟草腺毛的腺头细胞出现,说明NtALS1在这些细胞中特异表达。3.利用亚细胞定位网站对NtALS1进行预测,结果表明NtALS1定位于叶绿体。进一步克隆红花大金元NtALS1的CDS序列,构建35S启动子驱动NtALS1和GFP共同表达的亚细胞定位载体,以本氏烟草为受体,进行农杆菌侵染和瞬时表达,利用激光共聚焦显微镜采集荧光信号。结果表明,NtALS1的GFP信号与叶绿体自发荧光信号重叠较好,说明NtALS1定位于叶绿体。4.构建了含有3个NtALS1敲除靶位点的CRISPR Cas9载体,以烤烟品种K326为受体进行遗传转化;通过转基因阳性株鉴定和靶位点测序,获得T0代突变体14株,将其中ntals1-1和ntals1-2突变体收种并播种T1代株系;通过转基因阳性株鉴定和靶位点测序,从ntals1-1和ntals1-2的T1代株系中分别获得6株2 bp碱基插入纯合突变体和4株40 bp碱基缺失纯合突变体;利用GC/MS技术,检测其中3株ntals1-1和2株ntals1-2 T1代纯合突变体材料的烟叶表面分泌物。结果表明,两类突变体材料表面分泌物中主要二萜含量与野生K326相比,没有显著差异,然而糖酯含量显著低于对照。研究结果证明,NtALS1是参与烟草糖酯合成的关键基因。