论文部分内容阅读
狂犬病病毒糖蛋白至少有三种不同构型：自然形式(N)、激活的水溶性状态(A)和融合灭活构型(I)。当狂犬病病毒侵入宿主细胞时，糖蛋白调控使病毒囊膜与胞内体膜发生融合。胞内体内低PH的条件可造成糖蛋白构型的改变，并激活融合。当PH为5.8-6.0时病毒可发生融合，而在PH6.3以上就不能检测到此现象。因此，确定狂犬病糖蛋白融合的功能域，了解融合的机制对狂犬病的控制就具有深远意义。 本实验设计了GO／G10一对引物，用PCR分别扩增出狂犬病ERA株G基因及其4个缺失片段：G1G2、G3G4、G5G6、G7G8，将其分别克隆到pMD-18T载体上。用EcoR I／BstX I酶切pMD-G、pMD-G1G2、pMD-G3G4、pMD-G5G6和pMD-G7G8，纯化回收目的基因，亚克隆到真核表达载体pIREsneo上，构建了重组真核表达质粒：p-G、p-G1G2、p-G3G4、p-G5G6和p-G7G8。用脂质体转染的方法将纯化的重组真核表达质粒转染到仓鼠肾细胞(BHK-21)。经G418筛选，获得了表达糖蛋白的细胞克隆，将其挑出扩大培养。稳定传代后抽提细胞总DNA，用GO／G10引物进行PCR检测，扩增出了相应的G基因目的带，用免疫荧光试验也检测出了表达糖蛋白抗原，证明目的基因已经转染进细胞中，并且得到转录和表达。而且在阳性细胞冻存一个月后复苏，细胞仍具有G418的抗性，并能检测出目的蛋白，说明了G基因在细胞的传代及培养过程中不会丢失，且能稳定表达，从而为进一步研究狂犬病糖蛋白的融合性奠定了坚实的基础。