固有免疫应答是机体抵抗流感病毒的第一道防线,在控制和清除流感病毒及启动适应性免疫应答中起着至关重要的作用。自然杀伤细胞(NK细胞)为固有免疫细胞,是固有免疫系统的重要组分。流感病毒是一种常见的呼吸道感染病毒,是造成机体患流行性感冒的主要病原体。流感病毒感染呼吸道上皮细胞后,首先启动固有免疫应答。NK细胞在流感病毒感染中,一方面促进病毒的清除,发挥保护机体的作用;另一方面会导致免疫病理损伤,促进疾病发生。因此NK细胞在抗流感病毒感染中扮演双重角色。虽然NK细胞被归类为固有免疫细胞,近年来越来越多的研究表明NK细胞能像适应性免疫细胞—T和B细胞一样,具有免疫记忆、长期存活并介导再次免疫应答的能力。早期研究发现半抗原可以诱导记忆性NK细胞并诱发接触性超敏反应;小鼠巨细胞病毒(mCMV)感染和细胞因子的体外刺激也可以诱导出记忆性NK细胞。而近期的研究发现,小鼠的单纯疱疹病毒(HSV)、人巨细胞病毒(hCMV)、灵长类免疫缺陷病毒(SIV)等也可以诱导出记忆性NK细胞。是否能形成针对小鼠流感病毒的记忆性NK细胞以及相关免疫学机制,目前还知之甚少。在本论文中,我们建立小鼠流感病毒滴鼻感染模型。利用该模型探讨流感病毒感染中记忆性NK细胞的表型和功能。通过流式细胞术检测流感病毒感染中肺脏和肝脏NK细胞的表型;通过用灭活流感病毒进行体外刺激检测NK细胞的抗原特异性;通过RT-PCR和MDCK细胞-免疫组化方法检测小鼠肺脏组织中流感病毒的滴度;通过过继转输实验验证记忆性NK细胞的功能。最后通过流感病毒的滴鼻感染和灭活流感病毒的皮下免疫实验检测Rag1-/-鼠中记忆性NK细胞的形成和效应功能。主要实验结果如下:1.流感病毒感染快速活化肺脏NK细胞我们用鼠肺适应株流感病毒A/PR/8/34(简称PR8)滴鼻处理C57BL/6鼠,在感染第3天发现肺脏NK细胞数目明显增加,且能快速活化,活化性受体和活化性标志表达上调,抑制性受体略有下降。同时NK细胞分泌细胞因子IFN-γ的能力显著上调。而且感染1天时BALF中细胞因子IFN-α的水平显著增加。结果提示,流感病毒能快速招募NK细胞到肺脏中,并活化NK细胞,使其参与宿主抗病毒的免疫应答。2.NK细胞的缺陷和清除延迟流感病毒的清除为了证明NK细胞在流感病毒感染中的效应功能,我们分别应用C57BL/6鼠、NK细胞缺陷鼠(Nfil3-/-鼠)和抗体AsGM1清除NK细胞的C57BL/6鼠,观察流感病毒感染后机体清除病毒的功能变化。结果发现与对照组相比,NK细胞缺陷和清除的小鼠肺脏病毒的清除都显著的延迟,小鼠的体重减轻的更快,但是在感染后第3和7天的小鼠肺脏病理损伤并没有显著差别。结果提示,NK细胞在流感病毒感染中具有清除病毒的能力。3.流感病毒感染可诱导出肺脏记忆性NK细胞但保护效应较弱通过检测流感病毒感染30天后的肺脏NK细胞表面记忆性相关标志的表达变化,我们发现流感病毒感染诱导肺脏NK细胞上Ly6c和KLRG1表达上调,CD62L表达下调,呈现记忆性表型。通过灭活病毒的体外刺激实验,表明流感病毒感染30天后的肺脏NK细胞是流感病毒特异性的。给naive C57BL/6鼠转输病毒特异性的肺脏NK细胞可以略微减轻小鼠体重的下降程度,但对小鼠的生存率没有影响。结果提示流感病毒感染能诱导出肺脏记忆性NK细胞,但肺脏记忆性NK细胞的转输对流感病毒感染的保护效应较弱。4.流感病毒感染能快速活化肝脏NK细胞在流感病毒感染第3天我们对小鼠肝脏NK细胞的活化程度和功能进行分析,结果表明与肺脏NK细胞相似,肝脏NK细胞也能快速活化,且分泌IFN-γ的能力增加。但在肝脏中未检测到流感病毒,而感染24小时后血清和BALF中IFN-α的水平明显增加,这提示可能流感病毒感染诱导肺脏产生的IFN-α等细胞因子活化了肝脏NK细胞。5.肝脏NK细胞呈现记忆性表型且保护效应较强我们通过流式细胞术和体外刺激实验探讨流感病毒感染中活化的肝脏NK细胞是否具有记忆性,结果表明流感病毒感染30天后的肝脏NK细胞也呈现记忆性表型,且是流感病毒特异性的。给naive C57BL/6鼠转输病毒特异性肝脏NK细胞能显著减轻小鼠体重的下降程度,并增加小鼠的生存率。这些结果表明肝脏记忆性NK细胞的保护效应强于肺脏记忆性NK细胞。6.肝脏DX5-CD49a+ NK细胞介导对流感病毒的免疫记忆进一步分析发现流感病毒感染诱导出的肝脏记忆性NK细胞主要为DX5-CD49a+ NK细胞,且记忆相关转录因子(Hopx)表达上调。用灭活流感病毒刺激时这群NK细胞的功能增强。将病毒特异性的肝脏DX5-CD49a+ NK细胞转输给Rag1-/-鼠,能显著降低肺脏中流感病毒的滴度;而给naive C57BL/6鼠转输病毒特异性肝脏DX5-CD49a+ NK细胞能显著增加小鼠的生存率。这些结果提示肝脏DX5-CD49a+ NK细胞介导了对流感病毒的免疫记忆。7.灭活流感病毒皮下免疫诱导Rag1-/-鼠中形成记忆性NK细胞通过用灭活流感病毒皮下免疫Rag1-/-鼠发现,在Rag1-/-鼠也能诱导出记忆性NK细胞,再次病毒感染时发挥更强的抗病毒效应。进一步在Rag1-/-Nfil3-/-鼠和Rag1-/-tbx21-/-鼠中发现,也是肝脏DX5-CD49a+ NK细胞具有记忆性功能。这些结果提示记忆性NK细胞的形成不依赖于T和B细胞,Rag1-/-鼠中形成的记忆性NK细胞也定居于肝脏。综上所述,我们在小鼠呼吸道流感病毒感染模型中发现记忆性NK细胞的存在。记忆性NK细胞具有流感病毒特异性,主要存在于肝脏中,且主要是肝脏DX5-CD49a+NK细胞介导了对流感病毒的免疫记忆。因此,流感病毒感染模型为研究记忆性NK细胞形成、迁移和功能提供一个合适的平台。