泛素-蛋白酶体系统(ubiquitin-proteasome system,UPS),作为真核细胞内蛋白质特异性降解的主要途径,参与并调控了细胞周期、凋亡、免疫应答和信号传导等几乎所有的生命活动。泛素化修饰(ubiquitination)经过级联酶促反应(E1/E2/E3)生成泛素链,同时受到去泛素化酶(DUB)的可逆调控而处于动态平衡。泛素化修饰作为常见的蛋白质翻译后修饰(PTM),影响甚至决定了修饰蛋白的功能和命运,因此泛素化及其信号途径的任何突变或紊乱都可能诱发如癌症、神经退行性疾病等多种严重疾病。因此系统深入地研究泛素化及其修饰系统、鉴定泛素化相关酶的底物并揭示其调控机制,对于深刻认识生命活动、理解致病分子机制并研发相应治疗方法具有重要意义。泛素蛋白本身的7个赖氨酸残基和N端均可发生泛素化修饰,形成多种拓扑形式的泛素链,介导不同的生物学功能。研究最充分的K48链主要参与介导26S蛋白酶体(proteasome)的蛋白质降解;K11链参与内质网相关的蛋白质降解(ERAD)和细胞周期调控;K63链作为非降解信号,参与细胞内信号传导、核糖体氧化应激和DNA损伤修复等过程。发掘不同类型泛素链参与的生物学过程、解析其介导的生物学功能,有助于全面理解泛素所编码的语言。生命体之所以能够精准调控各种代谢活动、维持细胞的稳态与平衡,是基于细胞内各种酶与底物之间的特异性关系。越来越多的证据表明去泛素化酶与泛素链之间存在这种特异性关系。比如酵母细胞内去泛素化酶Ubp2更加倾向于切除K63链而不是K48链;相反,26S蛋白酶相关的去泛素化酶USP14更加倾向于切除K48链而非K63链。系统研究体内去泛素化酶与泛素链的特异性关系,为全面理解泛素化调控提供理论基础。如何揭示去泛素化酶与泛素链的特异性关系,成为泛素化研究的一大挑战。泛素化修饰底物蛋白上的多个赖氨酸残基均可被不同的泛素链修饰,形成了泛素化修饰的宏观不均一性(ubiquitination macroheterogeneity);在同一修饰位点也可形成不同种类的同质泛素链或混合泛素链,形成了泛素化修饰的微观不均一性(ubiquitination microheterogeneity)。鉴定泛素化蛋白特定修饰位点上发生修饰的泛素链类型、解析其介导的生物学功能,是深度理解泛素化修饰的调控基础,也成为泛素化研究的另外一大挑战。本课题利用定量蛋白组学系统研究细胞内去泛素化酶与泛素链的特异性关系,开发了基于两者特异性关系筛选特定泛素链修饰底物的筛选策略,揭示了去泛素化酶特异性参与泛素化宏观不均一性的调控过程,构建了“泛素链-底物蛋白-去泛素化酶-功能”的信息流,为系统、深入的理解去泛素化酶精准调控泛素化网络提供了数据基础和参考依据。为了系统评价体内去泛素化酶与泛素链的特异性关系,以芽殖酵母为研究对象,成功构建19株去泛素化酶单一敲除菌株。系统调查了不同突变菌株生长状况与泛素化水平变化,比如ubp3?、ubp14?等会造成泛素化水平的显著累积,且生长明显受到抑制。不同去泛素化酶的缺失对细胞生长影响各不相同,暗示其在细胞内调控的底物蛋白与发挥的功能各不相同。通过SILAC定量蛋白质组学系统比较19株突变株中7种泛素链的变化,显著累积的泛素链是其所偏好的底物泛素链。比如,我们证明了Ubp2主要调控细胞内K63链修饰的底物;Ubp14偏好游离非锚定的K29与K48泛素链,但是对游离的K63链偏好性不明显;Otu1与Otu2对7种泛素链的影响具有相似性,但是Otu1显著对K11泛素链具有偏好性。通过聚类分析去泛素化酶敲除引起7种泛素链的变化,发现同源去泛素化酶对泛素链变化的影响更加相似,比如Ubp9-Ubp13和Ubp4-Ubp5。然而,同源Ubp7和Ubp11的相关性却较小(R~2=0.44)。结构域分析表明,Ubp7与Ubp11的催化结构域聚类为同源去泛素化酶,但是Ubp7除催化结构域外还含有RHOD结构域,Ubp4和Ubp5同样含有该结构域。将ubp7?分别与ubp4?和ubp5?中泛素链定量值相比,表现出更高的相关性。该结果证明去泛素化酶的结构,包括催化结构域和功能结构域,共同影响去泛素化酶对泛素链的特异性关系。此外,泛素链的空间结构同样影响与去泛素化酶的特异性关系。聚类结果显示K11和K48链聚类到一起,这两种泛素链都采用紧密的空间结构。而K63链采用开放空间结构,明显与其他泛素链离群分开。最近的研究证明,溶液状态下K29和K33链采用开放构象,两者聚类到一起。该结果证明,泛素链的拓扑结构在一定程度上影响与去泛素化酶的特异性关系。本课题结合去泛素化酶与泛素链的特异性关系,第一次建立了特定泛素链位点特异性的泛素化底物筛选策略。通过本策略,可以筛选到底物蛋白上特定修饰位点发生的泛素链类型,并受到哪种去泛素化酶的调控。为了证明该策略的有效性,我们以Ubp2特异性调控K63链修饰为研究对象,系统筛选到Ubp2调控的100多个潜在的K63链修饰的底物蛋白。该策略最重要的优势在于可以确定K63链发生在底物蛋白具体的修饰位点,共鉴定到11个底物蛋白的修饰位点受到Ubp2的调控,同时推测上面发生K63链修饰。定量结果显示Ubp2并不是参与底物蛋白所有修饰位点的调控,而是精确到底物蛋白上的特定位点。本课题证明了Cpr1蛋白上多个位点发生泛素化修饰,其中K151位点上存在K63链修饰;而Cpr1其他位点如K29、K80和K139等主要被K48修饰。该结果证明了Cpr1泛素化修饰的宏观不均一性。通过SILAC-串联亲和纯化(TAP)策略系统筛选Cpr1的相互作用蛋白,证明了Cpr1还与Ubp2、Ubp3和Ubp7存在相互作用。除了Ubp2之外,Ubp3和Ubp7如何调控Cpr1的泛素修饰成为研究重点。实验结果显示Ubp3不仅参与非K151位点上K48链的调控,还参与K151位点上K63链的编辑;Ubp7主要参与非K151位点K48链的调控,但不参与K151位点调控。Cpr1不同位点的泛素链受到不同去泛素化酶的特异性调控,解析Cpr1上的泛素链介导的生物学功能有助于深刻理解泛素化修饰的调控关系。利用MG132抑制细胞体内26S蛋白酶体的活性,Cpr1的含量以及K48链修饰显著累加,其中非K151位点的KGG修饰显著累积,而K151位点变化不明显。这表明Cpr1上非K151位点的K48链介导了26S蛋白酶体降解过程,K151上的K63链并不介导此过程。为了研究Cpr1上K63链的功能,通过SILAC策略筛选K151点突变后与Cpr1相互作用减弱的蛋白。其中,锌指蛋白Zpr1显著与Cpr1存在相互作用,Cpr1点突变后相互作用减弱,这表明Cpr1上的K63链促进了与Zpr1的结合。实验证实当细胞受到葡萄糖刺激进入生长分裂状态,Cpr1帮助Zpr1进入细胞核;当Cpr1的K151位点突变,Zpr1入核效率降低。因此,Cpr1的K151位点上的K63链介导了与Zpr1相互作用并影响Zpr1的入核过程。综上所述,本课题发现了去泛素化酶泛素链特异性分布规律;开发了直接鉴定去泛素化酶的特定泛素链修饰底物泛素化位点鉴定技术,建立了泛素化蛋白质宏观和微观不均一性功能研究的技术体系;鉴定了系列Ubp2的K63泛素链修饰底物;以Cpr1为模型证明了去泛素化酶与泛素链间的特异性关系,阐述了特定去泛素化酶各自分工、互相协调参与底物蛋白上不同修饰位点泛素链的精准调控,发现了Zpr1-Cpr1-Ubp2的信号通路,揭示了一个新的“泛素链-底物蛋白-去泛素化酶-功能”信息流精准调控模式,为其它蛋白质翻译后修饰宏观和微观不均一性及其调控的二分之机制研究提供了一个范例。