大鼠基底前脑神经元nestin和ChAT mRNA表达及电生理特性

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基底前脑是一个高度异质性的区域,含有多种神经元,与不同的脑区发生联系,完成觉醒、感觉、运动、情感和学习记忆等多种功能。最近的研究发现在成年大鼠和成年人的基底前脑存在着一群nestin免疫阳性神经元,并认为这群神经元是区别于胆碱能神经元和γ-氨基丁酸(GABA)能神经元的成熟神经元。这群神经元的形态和分布与胆碱能神经元相似,发出纤维投射到海马、大脑皮质和丘脑,并与学习记忆功能密切相关。但基底前脑存在着能表达nestin的成熟神经元尚未在mRNA表达水平上得到证实,而且这群神经元的神经化学属性、电生理特征以及功能都还有待于进一步研究。   本课题运用全细胞记录技术结合单细胞反转录聚合酶链式反应(sc-RT-PCR)从mRNA表达和电生理特点两个方面证实基底前脑存在能表达nestin的成熟神经元(nestin-expressing neurons,NENs),并对NENs的递质属性、基本电生理特性及兴奋性突触传入的特征进行研究,以探索基底前脑成熟神经元表达nestin的机能意义。   实验发现乳鼠和成年大鼠基底前脑均有nestin mRNA表达。所有记录到的基底前脑nestin mRNA阳性细胞都是可兴奋细胞,给予一个短暂的去极化电流可诱发单个动作电位,给予一个较长的去极化电流可诱发多个连续的动作电位,证实这些nestin mRNA阳性细胞是成熟神经元,而不是神经干细胞或神经胶质细胞。   实验中共有106个神经元在记录后成功进行了sc-RT-PCR,其中有44个nestin mRNA阴性、胆碱乙酰转移酶mRNA阳性(nestin-& CHAT+)神经元(41.51%),35个nestin mRNA和胆碱乙酰转移酶mRNA双阳性(nestin+&CHAT+)的神经元(33.02%),5个nestin mRNA阳性、胆碱乙酰转移酶mRNA阴性(nestin+& ChAT-)神经元(4.72%),13个谷氨酸脱羧酶67 mRNA阳性(GAD67+)神经元(12.26%),9个囊状谷氨酸转运体mRNA阳性(VGLUTs+)神经元(8.49%)。88%的NENs表达ChAT mRNA,但没有NENs表达GAD67mRNA,或在ChAT mRNA阴性时表达VGLUTs mRNA。NENs的平均放电频为8.39±0.45 Hz,峰电位宽2.46±0.09 ms,超极化后电位时程223.77±12.08 ms、幅度4.49±0.21 mV,无明显的去极化凹(depolarizing sag,DS)和超极化激活的电流(Ih),长时间(4 s)的去极化未能引出簇状放电(cluster-firing)现象。这些特征与nestin-&CHAT+神经元相似,但与GAD67+神经元和VGLUTs+神经元有显著性差别。因此,mRNA表达和电生理特性两个方面的证据都说明基底前脑的大部分NENs属于胆碱能神经元。也就是说,基底前脑的胆碱能神经元可分为nestin阳性的胆碱能神经元(nestin+& CHAT+)和nestin阴性的胆碱能神经元(nestin-& CHAT+)。而且nestin+& CHAT-神经元的静息膜电位显著低于nestin&CHAT+的神经元(P<0.01),nestin+& CHAT+神经元的Ih显著大于nestin-&CHAT+的神经元(P<0.05),提示NENs膜兴奋性比nestin-& CHAT+神经元高。   Nestin+胆碱能神经元的自发的兴奋性突触后电流(sEPSC)的幅度(28.45±1.78 pA)显著高于nestin-胆碱能神经元(22.91±1.05 pA)(P=0.010);与nestin-胆碱能神经元相比,nestin+胆碱能神经元的事件幅度累积概率分布曲线偏右(K-S Z=4.5487,P=0.000),亦提示nestin+胆碱能神经元的sEPSC幅度显著高于nestin-胆碱能神经元。与nestin-胆碱能神经元相比,nestin+胆碱能神经元的sEPSC事件间期累积概率分布曲线偏左(K-S Z=2.6435,P=0.000),提示nestin+胆碱能神经元的sEPSC的频率高于nestin-胆碱能神经元。总之,与nestin-胆碱能神经元比较,nestin+胆碱能神经元的sEPSC幅度和频率都较大,提示其有较大的自发性的兴奋性突触传入。   独立样本的t检验表明,nestin+胆碱能神经元的微小兴奋性突触后电流(mEPSC)的幅度(29.01±1.83 pA)显著高于nestin-胆碱能神经元(22.64±1.06pA)(P=0.005);与nestin-胆碱能神经元相比,nestin+胆碱能神经元的mEPSC的幅度累积概率分布曲线偏右(K-S Z=8.2165,P=0.000),进一步证实nestin+胆碱能神经元的mEPSC幅度显著高于nestin-胆碱能神经元。与nestin-胆碱能神经元相比,nestin+胆碱能神经元的mEPSC事件间期累积概率分布曲线偏右(K-SZ=1.7174,P=0.006),提示nestin+胆碱能神经元的mEPSC的频率低于nestin-胆碱能神经元。配对资料的t检验发现nestin+胆碱能神经元的mEPSC的频率显著低于sEPSC的频率(P=0.033),而nestin-胆碱能神经元的mEPSC和sEPSC的频率之间无显著性差异(P=0.896),nestin-和nestin+胆碱能神经元的mEPSC与sEPSC的幅度之间无显著性差异(P值分别为0.816和0.720)。因此,nestin+胆碱能神经元的兴奋性突触传入高于nestin-胆碱能神经元的一个原因是nestin+胆碱能神经元的兴奋性传入的突触传递效率较高,另一个原因是nestin+胆碱能神经元的突触前兴奋性神经元自发性的动作电位活动更活跃。   NENs是一种慢放电神经元,其Ih显著低于GAD67+神经元,所以其在海马θ节律和学习记忆中的作用可能是提高海马神经元的兴奋性,增加θ节律的幅度,而不是作为海马θ节律的起搏细胞。与nestin-的胆碱能神经元相比,nestin+的胆碱能神经元由于的膜兴奋性较高、兴奋性突触传入效能较高、突触前兴奋性动作电位的较活跃,因此可能在学习记忆中具有比nestin-的胆碱能神经元更加重要的作用。基底前脑成熟神经元表达nestin可能是神经元提高其可塑性及生存能力、对抗基底前脑胆碱能神经元的丢失的一种机制,值得进一步深入研究。   总之,基底前脑存在着能表达nestin mRNA的成熟神经元。mRNA表达和电生理特征两个方面的资料都表明大部分NENs属于基底前脑的胆碱能神经元。nestin+的胆碱能神经元的膜兴奋性和兴奋性突触传入均高于nestin-胆碱能神经元,因此在θ节律和学习记忆中可能具有更加重要的作用。基底前脑胆碱能神经元能表达nestin mRNA可能是神经元提高可塑性及生存能力的一种机制。
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