研究背景大器官移植是一个国家器官移植水平的综合体现,而心脏移植是医学领域研究多项高精技术协作的结晶,也是衡量一个国家整体器官移植水平的重要依据之一。有人预测,到二十一世纪中叶,外科手术的一半都将是器官置换。世界上已有10多万人接受了心脏移植,而且这个数字还在以每年5000多例的速度增加。随着科学技术、手术技术和围手术期管理的技术不断提高,心脏移植术后成功的最大阻碍之一是术后急性排斥反应。脏器移植术后不同个体供、受体之间组织相容性存在的差异,产生的排斥反应也不相同。最理想的免疫抑制剂应用策略应该是脏器移植术后根据不同个体的排斥反应程度进行“个体化差异”免疫抑制剂应用,即以较小剂量的免疫抑制剂达到满意的抗排斥反应效果,以减轻药物的毒副作用,减轻经济负担。目前尚无简捷、无创、高效、实时的方法对排斥反应进行监测,因此免疫抑制剂很难做到“个体化”应用,以达到高效、低毒副作用的理想状态。急性排斥反应仍然是器官移植成功的最大障碍之一。因此,减少脏器移植术后患者的有创检查之痛苦,降低用药费用,减少药物的毒副作用,提高患者生存质量是我们无法回避的重大课题。探明移植排斥反应的分子机制,寻找高效、快捷、特异、敏感的排斥反应的监测方法,具有重大而深远意义。同种移植物排斥反应是由活化T细胞介导的细胞免疫反应,而细胞内钙及相关信息传递在T细胞激活、增殖和分化中起关键作用。探讨T淋巴细胞活化期间细胞内钙及其相关信息传递的内在联系,以及它们和心脏移植排斥的相关性,以进一步明确急性排斥反应的分子机制,探明分子水平监测急性排斥反应监测的新方法,为同种移植排斥反应的监测与防治寻找新的突破口。研究目的1.采用改良Ono氏腹腔异位心脏移植经典模型,总结手术心得,进一步探索心脏移植的理想模型,使之用于急、慢性排斥反应机理、免疫耐受、免疫排斥反应监测、抗心脏移植排斥反应药物筛选等临床和基础实验的研究更加方便。2.本项目从CD8+CD28+T淋巴细胞生物学特性及信号转导方向来研究免疫排斥反应的发病机理以及T细胞活化期间细胞内钙离子浓度的变化、细胞外放射性钙离子(45Ca2+)的摄取与心脏移植急性排斥反应(AR)的相互关系,可能会是器官移植研究新的突破口。3.从分子水平研究心脏移植术后急性排斥反应,有可能发现更多、更好、更有临床价值的治疗急性排斥反应的新药物；并能从细胞分子水平探明急性排斥反应的机制,为临床寻找急性排斥反应的早期诊断找到更简便有效的方法。研究方法1.大鼠腹腔异位心脏移植模型制作采用改良的Ono氏经典大鼠腹腔异位心脏移植模型法,先做预实验40组,再做正式实验80组。实验内容主要包括：供、受体麻醉→供、受体准备→供心摘取→受体心脏移植→术后观察等步骤。2.心脏移植急性排斥反应与CD8+CD28+T钙离子浓度变化的相关性研究2.1实验分组：T1组(正常大鼠组)：SD大鼠(n=24),术后1、3、5、7天每次随机抽取6只,6只为一组,共4组；T2组(假手术组)：SD大鼠(除不行心脏移植外,其他操过程都相同)动物模型(n=24),术后1、3、5、7天每次随机抽取6只,6只为一组,共4组；T3组(手术组)：同种心脏移植组,(WISTAR→SD大鼠)动物模型(n=24),术后1、3、5、7天每次随机抽取6只,6只为一组,共4组。2.2T1组、T2组和T3组分别分成术后1、3、5、7天4组,每组6只。各组大鼠进行腹主动脉取血,并处死大鼠,移植心脏做病理切片,按照AR分级标准(Stanford标准),进行分级。标本进行编号后行流式细胞仪分析等测定。2.3比较T1组、T2组和T3组研究移植前后大鼠CD8+CD28+T细胞内钙离子浓度变化规律以及这些变化与急性排斥反应是否有确定的量效关系。2.4统计学方法：所有数据均以均数±标准差(X±SD)表示,应用spss13.0统计软件对对照组、假手术组及模型组进行方差分析,如方差齐性,行方差分析,方差不齐,则行非参数检验。心脏移植组CD8+CD28+T淋巴细胞钙离子含量与AR进行非参数Spearman秩相关分析。P<0.05差异具有统计学意义。3.心脏移植急性排斥反应与CD8+CD28+T胞外45Ca2+摄取率的相关性研究3.1实验分组：T1组(正常SD大鼠组)24只,术后1、3、5、7天每次随机抽取6只为1组,共4组；T2组(同种心脏移植组,VISTAR→SD大鼠)24只,造模成功后,术后1、3、5、7天每次随机抽取6只,6只为1组,共4组。3.2CD8+CD28+T细胞获取：无菌条件下捣脾后,通过免疫磁珠分正负两步分选获取CD8+CD28+T细胞。3.3测定CD8+CD28+T细胞外45Ca2+摄取率：用玻璃纤维滤纸收集CD8+CD28+T细胞,干燥后用液闪仪测定每分钟脉冲数(cpm)。3.4统计学方法：实验组与对照组采用Mann-Whitney U test检验,实验组CD8+CD28+T细胞外钙摄取率与AR的分级进行秩相关分析。所有数据均以均数±标准差(X±SD)表示,使用SPSS13.0统计软件进行分析。P<0.05差异具有统计学意义。图1.本项目实验方案流程简图Figure1. The project program flow diagram研究结果1.大鼠腹腔异位心脏移植预实验40例,存活21例,成功率52.5%。主要死亡原因是术中创伤大,分离血管操作粗暴至大血管破裂致大鼠休克不能存活,供心摘取时间长、吻合血管时间长心脏不能复跳,大鼠休克不能存活。预实验完成后,总结经验教训,加强围手术期的处理,再进行正式实验,手术并发症明显减少。正式实验80例存活70例,存活率87.5%。与预实验组对比,正式实验组冷、热缺血时间、心脏复跳时间、腹主动脉阻断时间显著降低,手术成功率显著上升,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.移植心脏病理切片分级(详见下图,HE×400)。AR的分级参照Stanford标准进行AR的分级。0级：无排斥,心肌组织正常,无心肌间质单核细胞浸润。1级：有局灶性血管外、心肌间质单核细胞浸润,不伴心肌细胞损害。2级：单灶性单核细胞浸润,小灶状心肌细胞损害。3级：弥漫性单核细胞浸润合并损坏或心肌坏死。4级：弥漫性多类型细胞浸润,明显心肌间质水肿、出血和心肌坏死。由南方医科大学病理学教研室完成。Stanford0级Stanford1级Stanford2级Stanford3级Stanford4级3.假手术组在术后第5天发现少量炎性细胞浸润,未发现心肌水肿、坏死等急性排斥反应的表现。模型组在术后第1天只发现局灶性炎细胞浸润及小灶状心肌细胞坏死,第3天排斥反应最重,可见弥漫性多类型细胞浸润,明显心肌间质水肿、出血和心肌坏死,第5天次之,但仍可见炎性细胞浸润、心肌细胞坏死,第7天减轻。模型组内各时间段组CD8+CD28+T细胞内钙离子浓度较假手术组、对照组显著增高(P<0.01),假手术组与对照组CD8+CD28+T细胞内钙离子浓度差异无统计学意义(P>0.05)。说明术后CD8+CD28+T淋巴细胞内钙离子浓度与术后心脏移植发生急性排斥反应有关,与手术创伤无关.Spearman相关分析表明CD8+CD28+T细胞内钙离子浓度与AR的严重程度成正相关,相关系数为0.358,相关显著(P<0.05)。4.术后第3、5天实验组的钙摄取率[CR:T Mφ(+)/T Mφ(-)]比对照组高,差异有统计学意义(P<0.05)。第1、7天差异无统计学意义(P>0.05)。Spearman相关分析表明CD8+CD28+T细胞外钙摄取率与AR的严重程度成正相关,相关系数为0.436,相关显著(P<0.05)研究结论1.通过预实验建立大鼠心脏移植模型,总结手术心得,结果显示正式实验较预实验冷、热缺血时间、心脏复跳时间、腹主动脉阻断时间明显缩短,手术成功率显著提高。Ono大鼠腹腔异位心脏移植方法是心脏移植的基本模型,心脏移植的理想模型以手术方法简单、供心缺血时间短、术后模型稳定利于长期实验观察为标准。尽管,经过很多代医学前辈的的不断实践与努力,大鼠异位心脏移植模型较之前已取得了很大的改进和创新,但是在动物模型的很多操作技巧上仍有不少值得商榷的地方,需要我们继续努力。2.Ca2+在人体内不但具有重要的生理功能,在组织或细胞产生病理反应时其浓度还能反映机体或细胞的病变程度,Ca2+作为细胞内的重要信息传递物质,具有调节细胞功能、参与信号跨膜传递以及介导细胞对外界刺激的应答反应等重要作用。3.同种移植物排斥反应是T淋巴细胞介导的细胞免疫反应,即通过相应抗原所激活的T细胞聚集于移植物并释放细胞活性因子产生的免疫损害。T淋巴细胞具有多种调节功能,即辅助功能、移植功能和效应功能,这些功能的正常发挥有赖于T细胞从静止状态转变为激活状态。在同种移植急性排斥反应过程中,激活状态的T淋巴细胞介导的细胞学免疫反应是引起免疫排斥反应并导致移植物功能损害的关键。4.本研究发现心脏移植大鼠急性排斥反应严重程度与CD8+CD28+T细胞表达增高成正相关。CD8+CD28+T淋巴细胞内的钙离子浓度显著增加与心脏移植后急性排斥反应发生及加重有紧密的关系,且随急性排斥反应的加重而增高。进一步深入研究外周血CD8+CD28+T淋巴细胞内的钙离子浓度,有助于对急性排斥反应做出诊断。5.本研究发现心脏移植大鼠急性排斥反应严重程度与胞外钙离子摄取成正相关性,CD8+CD28+T细胞外钙摄取率可以通过液体闪烁计数仪精确测定,所以这种方法有望成为临床上一种诊断急性排斥反应简便,有效的方法。