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地鳖虫（Eupoliphaga Sinensis Walker）是一种传统的中药材，具有散血淤、解凝活血、接骨续筋等功效。现代医学研究及临床试验证明地鳖虫具有抑制肿瘤、调节血脂、抗衰老等功效，其药食两用的特性使得地鳖虫的研究越来越受到人们的关注。地鳖虫蛋白质含量很高，以干重计，地鳖虫蛋白质含量高达60％以上，是典型的高蛋白食品。目前对地鳖虫的研究主要集中在其初级加工工艺及药理作用方面，对其蛋白质以及抗氧化活性方面的研究却鲜有报道。本文以地鳖虫为原料，利用从韩国引进的Arazyme高效蛋白酶对地鳖虫酶解工艺进行优化，通过体外实验评价酶解液对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基及亚油酸自氧化反应的抑制效果;利用阳离子交换层析技术、阴离子交换层析技术、制备型高效液相色谱技术分离酶解液中的抗氧化肽，并测定各组分的抗氧化活性。主要研究内容及成果如下:
1.本研究利用从韩国引进的高效Arazyme蛋白酶酶解地鳖虫，在单因素试验的基础上，采用响应面分析法对酶解工艺进行优化，得到的最佳工艺参数为:每克地鳖虫的加酶量为308.6U;酶解时间5.3h;水料比21.6∶1，在此条件下得到地鳖虫酶解液中肽键含量为10.423mmol/g·pro，与理论值10.462mmol/g·pro较为接近。这说明响应面法对地鳖虫酶解条件的优化具有实际应用价值。
2.将地鳖虫酶解液进行冷冻干燥后，配成不同浓度的样品液，使得其在·OH、O2-·、DPPH反应体系中的终浓度分别为10～50mg/mL、0.5～2.5mg/mL、16～80μg/mL;另取地鳖虫酶解液冻干粉用50mmol/L的PBS(pH=7.0)配成肽含量分别为1.1mg、1.3mg、2.0mg的样品液。结果表明:地鳖虫酶解物对·OH、02-·、DPPH三种自由基的最高清除率分别为75.15％、31.72％、74.88％，对亚油酸自氧化反应的抑制率最高为95％。由于亚油酸体系是目前国内外分离抗氧化肽时普遍采用的指标，因此在后续分离过程中采用样品对亚油酸自氧化反应的抑制作用作为分离依据。
3.采用阳离子交换层析技术、阴离子交换层析技术以及高效液相色谱对地鳖虫酶解液中的抗氧化肽进行分离纯化，同时测定各个组分对亚油酸自氧化反应的抑制作用。在起始缓冲液为0.02mol/L pH=4.0的醋酸缓冲液，上样量为50mg，NaCl洗脱浓度为0.25mol/L的条件下，得到阳离子交换层析的四个组分FⅠ，FⅡ，FⅢ，FⅣ，其对亚油酸自氧化反应的抑制率分别为73.69％，79.25％，43.65％，0％。在起始缓冲液为0.02mol/LpH=8.0的Tris-HCl缓冲液，上样量为50mg，NaCl洗脱浓度为0.25mol/L的条件下，对FⅡ进行阴离子交换层析得到两个组分，FⅡ-Ⅰ，FⅡ-Ⅱ，其对亚油酸自氧化反应的抑制率分别为73.3％和81.83％。利用制备型高效液相色谱技术对FⅡ-Ⅱ继续分离，结果表明，在保留时间13min处可以得到一个单一峰FⅡ-Ⅱ-Ⅰ。