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在当代严重威胁人类健康与生命的疾病中,心肌梗死(Myocardial Infarction,MI)是引发死亡的主要原因之一。心梗发生后,由于缺血、缺氧引发心肌细胞凋亡坏死,致使患者心功能障碍,最终可导致心力衰竭。在临床治疗中,对心肌梗死患者常采用介入治疗、冠状动脉搭桥术等方法,可有效地阻止梗死面积的扩大,同时,还需加强药物治疗。因此,应从多维角度出发,寻找新的有效药物及其治疗靶标,为多靶点、多途径预防和治疗心肌梗死提供新的策略。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(Histone deacetylases inhibitor,HDACI)可以抑制组蛋白去乙酰化酶活性,在转录水平上调控相应基因表达,进而影响细胞周期、细胞分化及凋亡等生物学反应。丁酸钠(Sodium butyrate,NaBu)作为一种HDACI,在心肌梗死大鼠治疗中发挥保护作用。实验室前期工作表明,丁酸钠能够减少心梗大鼠心脏的梗死面积,同时还能上调丙酮酸激酶M2亚型(Pyruvate kinase M2,PKM2)的表达,增强糖代谢,提高组织内ATP的含量。PKM2常见于除肝脏、以及脑以外的绝大多数组织中。它是糖酵解途径中的关键酶,在细胞质中可以催化二磷酸腺苷和磷酸烯醇式丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)分别转变为三磷酸腺苷和丙酮酸。现有研究表明,PKM2在一定刺激下能转移至细胞核,调控相应蛋白的合成。在肿瘤细胞中,EGFR能增进细胞质中的PKM2向核内转移并与磷酸化的β-连环蛋白(β-catenin)结合,共同构成转录调节复合物,促进细胞周期蛋白D1(CyclinD1)的表达,使细胞快速增殖。PKM2在细胞核内可发挥其磷酸酶作用,HIF-1α介导PKM2活化STAT3,P-STAT3反过来促进HIF-1α转录,形成HIF-1α-PKM2-STAT3反馈环。此外,近期研究发现在NCI-H1299肺癌细胞中,PKM2在IGF-1信号传导下发生核转移,可诱导STAT5活化发挥其转录因子活性。目前,在心脏疾病中PKM2的研究仍然较少,尤其是在细胞核中发挥的作用尚未见报道。综上所述,我们推测,在心肌梗死大鼠中,丁酸钠通过促进PKM2入核,影响STAT5功能,降低大鼠心脏组织凋亡水平。研究目的:本实验旨在研究丁酸钠对心肌梗死大鼠心脏组织凋亡的影响,明确PKM2入核在该过程中发挥的作用,探讨丁酸钠保护心梗大鼠心脏的潜在机制。实验方法:本实验选用健康雄性Wistar大鼠,通过冠状动脉左前降支结扎术建立心肌梗死模型,采用术前连续7天预防给药和术后维持治疗给药,除假手术组和模型组给予生理盐水外,其余各组分别给予丁酸钠或紫草素(PKM2抑制剂),术后分别于1d、2d、3d、7d、14d取材;采取TTC法检测大鼠心梗面积;使用血清酶活性检测试剂盒检测大鼠血清中AST、LDH、SOD活性,使用ELISA试剂盒检测CK-MB、MDA浓度;采用超声心动图观察心肌梗死大鼠的心功能的时程变化;采用HE染色观察大鼠心肌组织结构;采用透射电镜察看大鼠心肌细胞超微结构;使用核质分离试剂盒提取各组大鼠心脏组织中的细胞核与细胞质蛋白;采用免疫共沉淀检测大鼠心脏中PKM2与STAT5的相互作用;采用Western blot方法检测PKM2、STAT5、P-STAT5、Bcl-2、Caspase-3等蛋白的表达;采用TUNEL染色法检测细胞凋亡程度。实验结果:(1)TTC染色结果表明,假手术组大鼠心脏几乎未发生梗死,模型组心梗面积于1d、2d、3d、7d、14d各时间点均显著增加(P<0.001),模型组给予丁酸钠后,大鼠心肌梗死面积明显降低(P<0.05)。血清酶学结果表明,模型组大鼠血清AST活性在心梗发生后升高且1d达到峰值(P<0.001),CK-MB浓度自2d起呈不同程度的增加,LDH活性于3d和7d显著增加(P<0.05);MDA浓度自3d起呈不同程度的增加,以3d和7d较为显著(P<0.05),SOD活性在各个时间点均呈不同程度下降(P<0.05),以2d和14d最为明显(P<0.001);在同一时间点,当模型组给予丁酸钠时,AST活性呈不同程度下降,以7d降低最为显著(P<0.001),CK-MB浓度和LDH活性均下降(P<0.05);MDA浓度下降(P<0.05),以3d和14d下降最为显著(P<0.001),SOD活性呈不同程度升高。超声心动图显示模型组大鼠射血分数下降显著(P<0.01),当模型组给予丁酸钠时,大鼠射血分数在1d和7d显著提升(P<0.01)。(2)HE染色结果显示,假手术组心肌组织致密且整齐排列。模型组心肌组织排列紊乱,出现明显的水肿以及大量炎性细胞浸润;当模型组给予丁酸钠时,心肌组织排列紊乱程度降低,水肿程度减轻,炎性细胞浸润减少。透射电镜结果显示,假手术组心肌纤维排列整齐且致密,肌节内明带暗带清晰且界限清晰,大量线粒体沿心肌纤维走行整齐排列,细胞核四周心肌纤维排列整齐。模型组肌丝束出现不同程度的溶解、断裂或消失,明暗带分界模糊,部分线粒体出现空化,细胞核周围心肌纤维排列尤为紊乱。当模型组给予丁酸钠时心肌纤维排列相对整齐,肌丝束轻微溶解,线粒体排列相对整齐清晰。(3)核质分离结果表明,与假手术组相比,模型组核蛋白PKM2含量在3d时增加明显(P<0.01);当模型组给予丁酸钠时,核蛋白PKM2含量在除3d外呈现不同程度的增加,以7d增加最为显著(P<0.001);当模型组给予丁酸钠和紫草素时,核蛋白PKM2含量除3d明显下降(P<0.05)。(4)免疫共沉淀结果显示在大鼠心脏组织中,PKM2能与STAT5结合。Western Blot结果显示,与假手术组相比,模型组P-STAT5和Bcl-2表达量下降显著(P<0.001),Caspase-3裂解水平明显增加(P<0.01);当模型组给予丁酸钠时P-STAT5明显提高(P<0.05),Bcl-2和细胞核内STAT5及P-STAT5含量提升明显(P<0.05),Caspase-3裂解程度明显下降(P<0.05);当模型组给予丁酸钠和紫草素时,P-STAT5下降明显(P<0.05),Bcl-2和细胞核内P-STAT5表达量均明显下降(P<0.05),Caspase-3裂解程度略有提升。各组之间细胞质内STAT5及磷酸化的STAT5含量均无明显差异。(5)TUNEL染色结果显示假手术组以及当假手术组给予丁酸钠时心肌组织几乎未发生凋亡;模型组心肌组织中凋亡的细胞数增多;当模型组给予丁酸钠时凋亡细胞数明显下降;当模型组给予丁酸钠和紫草素时,心肌组织中细胞凋亡数增加。实验结论:(1)在心梗大鼠中,丁酸钠能够保护心肌细胞结构,减少心肌组织凋亡,改善大鼠心功能;(2)丁酸钠可能通过促进PKM2入核,影响STAT5的磷酸化水平,上调Bcl-2的表达,发挥抗凋亡活性。