主动脉夹层是指主动脉内膜破裂,血液从内膜破裂口进入中层,使主动脉壁分离,形成真假两腔的一种疾病。目前对其处理除了内科药物控制血压等保守治疗外,已不再仅仅局限于常规剖胸手术,而主动脉腔内修复术已经成为重要的救治方法。该方法实现了从剧创到微创的演变,具有安全、有效及并发症少等优点。由于其效果确切等诸多优点,治疗范围逐渐拓宽到主动脉弓降部、弓部乃至升弓部主动脉病变。为此,在治疗过程中往往涉及到主动脉弓部的主要分支,如左颈总动脉及左锁骨下动脉的处理问题,而盲目覆盖其开口很可能引起脑缺血性损害,过度扩大分支间搭桥指征又会增加手术风险。对此,尚无统一意见,亦无较为系统的动物实验研究。为此,本研究模拟临床上主动脉腔内修复术中永久性完全覆盖左锁骨下动脉、左颈总动脉开口的情况而建立相应的动物模型,探讨阻断兔左锁骨下动脉和/或左颈总动脉后对脑部供血以及脑功能的影响,并观察脑组织核转录因子-KB(nuclear factor-κB, NF-κB)、低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF-1)的表达及组织形态学改变,为临床上主动脉腔内修复术中如何处理弓部分支提供实验依据,从而避免盲目覆盖左锁骨下动脉和/或左颈总动脉开口,也更好地掌握弓部分支搭桥的手术指征。第一部分实验动物模型制备目的：解剖兔左锁骨下动脉、左颈总动脉,并套线备用,为进一步实验研究建立动物模型。方法：1.实验动物健康成年日本大耳白兔,实验动物总数30只,体重在3～3.5kg,雌雄不限,清洁级,由武汉市万千佳禾实验动物养殖有限公司提供。2.动物入选标准所有实验动物均行血管造影,明确Willis环完整后纳入本实验分组。3.制备过程血管造影：戊巴比妥钠30mg/kg耳缘静脉麻醉,并观察动物呼吸及心跳情况。麻醉成功后仰卧位固定于手术台上。剔除胸部、颈部及双下肢内侧绒毛。解剖右侧股动脉后行股动脉置管,导管室内再行脑血管造影。手术过程：保持自主呼吸,胸前区活力碘消毒后,沿胸骨中线自胸锁关节至剑突上切开皮肤。自剑突上2cm向上正中剪开胸骨,小心操作保护胸膜,小动物开胸器撑开胸骨,分离胸骨上窝处胸腺组织,充分暴露术野,解剖左颈总动脉和左锁骨下动脉,两动脉起始部双重套3-0普通丝线(强生医疗器械有限公司)备用,术毕。结果：本实验中实验动物共30只,麻醉后血管造影显示Willis环完整。其中预实验3只,手术成功2只,死亡1只,死因为开放性气胸；其余27只动物中,模型成功24只,成功率为88.9%,3只死亡,其中有2只死于开放性气胸,1只死于失血性休克。结论：本研究是模拟临床上主动脉腔内修复弓部病变的过程中,为扩大锚定区或修复弓部病变需覆盖左锁骨下动脉甚至左颈总动脉开口的情况而设计的。而本实验为后续的研究制作相应的动物模型,解剖左锁骨下动脉、左颈总动脉。本研究选择兔作为研究对象,是因为兔和人类脑血管结构非常相似,是脑缺血模型的首选动物,同时由于兔的胸腔被纵隔分为互不相通的左右两部,避免了术中呼吸机的使用,使实验更加简便易行；另外,兔作为中型的实验动物,较易饲养、成本合理。而小动物如小鼠、大鼠等,血管较细,仪器检测较困难。大型动物如犬、猪等饲养条件苛刻,且成本较高。当然,此模型的建立也有其不足之处,因为兔左锁骨下动脉位置较深,通过颈部切口显露不佳,需采用开胸建立模型的方法,从而加大了手术创伤。第二部分阻断兔左锁骨下动脉、左颈总动脉对脑部供血及功能影响的实验研究目的：探讨阻断兔左锁骨下动脉、左锁骨下动脉和左颈总动脉后对脑部供血及功能的影响。方法：1.实验动物分组及处理将前一部分准备好的实验动物模型随机分为三组：实验组1即只阻断左锁骨下动脉；实验组2同时阻断左锁骨下动脉和左颈总动脉,正常对照组只解剖左锁骨下动脉、左颈总动脉,套线而不阻断,每组8只。2.血管造影实验组1、2阻断完成后行血管造影,明确阻断效果及侧支循环开放情况。3.数据采集及计算动物血管造影后,待呼吸循环平稳约10分钟后麻醉状态下行超声检测,将7.5MHz高频探头置于颈部两侧,纵向扫描显示双侧颈总动脉长轴及颈椎横突声影,选择第3、4颈椎横突之间血管层面测量三组双侧椎动脉及颈总动脉血管直径、收缩期流速(peak systolic velocity, PSV)、血管阻力指数(resistive index, RI)、平均流速(mean blood flow velocity, Vm)等血流动力学指标。所有参数均测量4个心动周期,再取其平均值,并通过公式计算血流量(blood fow volume,BFV)[BFV=Vm×(直径/2)2×π×60],同时计算入颅总血流量(total blood flow into cranial,TBFIC)(TBFIC=BFV左颈总动脉+BFV右颈总动脉+BFV左椎动脉+BFV右椎动脉[11])。另外,在实验过程中,观察动物生命体征、运动能力,再对脑功能影响进行综合评分；若其评分>2分,判为有脑缺血损伤。4.数据统计所有数据均采用SPSS13.0统计分析软件分析,计量资料均用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD法检验,P<0.05认为有显著性差异。结果：1.侧支循环检查阻断左锁骨下动脉、左颈总动脉后血管造影提示：两实验组动物所阻断的血管内均未见正向血流显影,而其Willis环较阻断前显影明显。这说明血管阻断完全,脑血管侧支开放,右侧脑部血流通过侧支循环供应左侧。2.入颅总血流量变化实验组1,2及正常对照组的入颅血流量分别为(58.3952±13.3812)ml/min、(50.5544±12.0246)ml/min、(57.1611±11.6684)ml/min。虽然实验组2平均入颅血流量较正常对照组有所减少,实验组1入颅总流量略有增加,但彼此之间差异无统计学意义。这说明在阻断左锁骨下动脉、左颈总动脉后,其余血管发挥其代偿机制,使得入颅总血流量趋于稳定。3.右侧椎动脉血流动力学变化(见表1)三组间比较椎动脉直径彼此无明显差异。实验组1RI较正常对照组低,而实验组2最低,即低于正常对照组及实验组1,彼此间差异均有显著性(P=0.030,0.000,0.003)。虽然实验组1PSV、BFV分别高于正常对照组,Vm低于正常对照组,但其差异均无显著性；而实验组2上述三项指标均高于正常对照组对应值,且差异均具有显著性(P=0.000,0.000,0.000)；两实验组比较,实验组2均高于实验组1,差异亦具有显著性(P=0.000,0.001,0.000)。上述结果说明单纯阻断左锁骨下动脉后,对侧椎动脉PSV、BFV及Vm变化不明显,只是其血管阻力降低；而同时阻断左锁骨下动脉和左颈总动脉后对侧椎动脉血管发挥显著代偿作用,不仅血管阻力降低,而且血流速度加快,血流量增加,以保证大脑供血少受影响。4.右颈总动脉血流动力学变化(见表2)三组间比较,右颈总动脉直径彼此无明显差异。实验组1、2右侧颈总动脉的RI均较正常对照组低,差异都具有显著性(P=0.005,0.007),但两实验组之间差异无显著性。实验组2右侧颈总动脉PSV、Vm、BFV均高于正常对照组的对应指标,差异具有显著性(P=0.000,0.000,0.000)；实验组1PSV低于正常对照组,而其Vm及BFV分别高于正常对照组,但变化差异无统计学意义。实验组2上述指标同样高于实验组1,且差异具有显著性(P=0.000,0.000,0.001)。上述结果说明,实验组1只需通过降低右侧颈总动脉血流阻力即可满足大脑麻醉状态下的供血需求；而实验组2还需右侧颈总动脉发挥更大的代偿作用,不仅血流阻力下降,而且其流速加快,流量增加。5.左侧椎动脉血流动力学变化(见表3)三组间比较,左侧椎动脉直径彼此间无明显差异。实验组1及实验组2其左侧椎动脉内为逆向血流,RIPSV、Vm、BFV均低于正常对照组,差异有显著性(P=0.004,0.000,0.002,0.002；P=0.013,0.000,0.005,0.025)；两实验组比较,以上指标无显著性差异。上述结果说明,阻断左锁骨下动脉、左颈总动脉后,脑血管侧支循环发挥其代偿功能,使右侧血流供应左侧,以防止后脑及左上肢缺血。6.左侧颈总动脉血流动力学变化三组间彼此比较,左侧颈总动脉直径无明显差异。实验组1左侧颈动脉RI、PSV、Vm及BFV与正常对照组比较均无显著差异。实验组2结扎左锁骨下动脉和左颈总动脉后,颈动脉内未见血流信号。该结果说明单纯阻断左锁骨下动脉对左颈总动脉血流无明显影响,而近心端阻断左锁骨下动脉和左颈总动脉后其内无逆向血流。7.脑功能评定实验观察8小时,三组动物生命体征均正常,未见四肢活动障碍,对外界刺激反应灵敏,脑功能评分均<2分,彼此间无显著性差异。上述结果说明,单凭动物短时间内表现及脑功能评分,尚未发现单纯阻断左锁骨下动脉和同时阻断左锁骨下动脉、左颈总动脉对大脑影响有明显差别,对此,还需进一步研究。结论：本研究结果提示在Willis环完整条件下,阻断左锁骨下动脉、左颈总动脉后入颅总血流量无明显变化,而起源于左侧锁骨下动脉的左侧椎动脉可见逆向血流,但血流量较正常对照组减少,说明与左椎动脉窃血有关,并通过腋动脉供应左侧上肢血流。单纯阻断左锁骨下动脉后,右侧颈总动脉及右侧椎动脉仅血流阻力下降,而其血液流速及流量变化不明显,说明大脑VVillis系统仍有潜在的代偿能力,满足大脑供血增大的需要；但同时阻断左锁骨下动脉和左颈总动脉后,右侧颈总动脉及右侧椎动脉发挥了更为明显的代偿作用,其血管阻力下降,流速加快,流量增加等,才使麻醉状态下入颅总血流量下降较少。由此可以推断在Willis环完整的条件下,主动脉腔内修复术中只覆盖左锁骨下动脉开口对脑部供血无明显影响；但同时覆盖左锁骨下动脉和左颈总动脉开口后,虽然对侧颈总动脉、椎动脉及VVillis系统发挥其代偿作用,但仍然存在大脑供血与需求失衡的可能性。单纯阻断左锁骨下动脉与同时阻断左锁骨下和左颈总动脉后,动物均未见明显脑缺血的功能损害表现。这与对侧颈总动脉、椎动脉等代偿有关,但彼此之间是否存在脑缺血损害的差异,尚须进一步研究。第三部分阻断兔左锁骨下动脉、左颈总动脉后脑组织形态学改变及核转录因子-κB、低氧诱导因子-1α的表达目的：探讨阻断兔左锁骨下动脉、左锁骨下动脉和左颈总动脉后脑组织是否有缺血性损害。方法：1.实验动物及分组同第二部分；2.实验处理同第二部分；3.实验方法及原理3.12,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色法TTC染液可使正常组织呈鲜红色,而梗死区呈苍白色。在兔左锁骨下动脉及左颈总动脉阻断8小时后,生理盐水灌注颅脑,再断头取出脑组织,前四只所取脑组织即放入-20℃冰箱中保存30分钟,取出后行脑组织切片,切片均匀,每片厚度保持在5mm左右,再将切片放于配好的TTC染液中,避光染色30分钟,用图像分析软件(Image Pro Plus Version4.5,美国Media Cybernatics公司)计算梗死面积百分比。3.2HE染色及链霉亲和素—生物素—过氧化物酶复合物技术(Strept Avidin-Biotin Complex method, SABC法)脑组织石蜡包埋后常规石蜡切片,部分切片经脱蜡、梯度脱水、HE染色；部分切片经3%H2O2作用20min灭活组织中的内源性过氧化物酶；蒸馏水洗,微波修复抗原,分别滴加鼠抗兔NF-K Bp65、HIF-1α多克隆抗体(NF-κB、HIF-1α是与组织缺血有关的高敏指标,在缺血组织中会有高表达),37℃、30mmin,4℃过夜；磷酸盐缓冲液(PBS)洗3次,滴加生物素化羊抗兔IgG,37℃、30min,PBS洗涤后,滴加SABC复合物,37℃反应30min；PBS和蒸馏水洗涤后,滴加DAB显色试剂,显微镜下观察控制显色时间。以PBS代替生物素化羊抗兔IgG作为空白对照,以已知的阳性切片标本作为阳性对照,观察脑组织NF-κB、HIF-1α的表达。4.数据统计所有数据均采用SPSS13.0统计分析软件进行统计分析,计量资料用均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析(one-way ANOVA),两两比较采用LSD法检验,P<0.05认为有显著性差异。结果：1.TTC染色本实验正常对照组脑组织染成鲜红色,实验组1仍可见脑组织红染,未见明显梗死区。但实验组2可见1只动物(12.5%)左侧部分脑组织呈现苍白色,梗死面积百分比为(15±5)%。说明单纯阻断左锁骨下动脉后,TTC染色未显示严重缺血性损害；而同时阻断左颈总动脉后,脑组织缺血损害明显,有的动物已出现脑梗死区。2.病理观察光镜(×200)下见正常对照组脑组织结构清楚,细胞排列整齐,神经元细胞胞浆丰富,胞核清晰,胶质细胞形态结构正常；实验组1细胞排列整齐,神经元结构正常,仅少数脑组织可见轻度水肿,少量炎性渗出,但其半定量分析结果与正常对照组相比,无显著性差异。然而实验组2部分脑组织水肿明显,神经元细胞皱缩,炎性渗出增多,其半定量分析结果高于正常对照组,差异显著(P=0.000),上述指标亦显著高于实验组1(P=0.000)。上述结果说明,单纯阻断左锁骨下动脉后,对脑组织供血影响较小,组织缺血性损伤不明显；而同时阻断左颈总动脉后,脑组织缺血加重,脑细胞水肿,神经元细胞皱缩,炎性渗出增多。3.NF-κB、HIF-1α的表达本研究中实验组1和正常对照组中均偶有表达,但两组相比无显著差异。但是阻断左锁骨下动脉和左颈总动脉后,NF-κB、HIF-1α表达明显升高,可见部分细胞被染成棕黄色,其阳性单位及阳性率显著高于正常对照组(P=0.000,0.000；P=0.000,0.000),同单纯阻断左锁骨下动脉相比,差异亦具有显著性(P=0.000,0.000；P=0.000,0.000)。以上结果说明,单纯阻断左锁骨下动脉后,脑组织缺血性损害不明显；而同时阻断左颈总动脉后,脑组织缺血性改变明显,炎症反应加重,诱导了NF-KB、HIF-1α的高表达。结论：本实验表明在大脑Villis环完整情况下,单纯阻断左锁骨下动脉并未引起脑组织明显缺血的病理改变及NF-κB、HIF-1α高表达；但同时阻断左颈总动脉,即使其Willis环完整,仍引起了大脑缺血的病理学改变和NF-κB、HIF-1α高表达。由此可见,本实验进一步为临床上主动脉腔内修复术中单纯永久覆盖左锁骨下动脉开口的可行性、同时覆盖左锁骨下动脉和左颈总动脉开口行搭桥转流的必要性提供了实验依据。