小胸鳖甲(Microdera punctipennis)隶属于鞘翅目拟步甲科,是新疆的特有种,分布在新疆北部的准噶尔盆地古尔班通古特沙漠。该地区气候严酷,冬季漫长严寒,具有季节性温差和夏季昼夜温差巨大的特点。甲虫M.punctipennis适应当地环境,进化出了对寒冷和极端温度变化等多种逆境胁迫的适应性,而对其耐寒性的研究有助于了解昆虫对极端荒漠环境的适应性机制。在低温条件下,昆虫不仅要应对低温胁迫,而且由于其细胞代谢降低,还会受到微生物病原体的胁迫。因此,昆虫的耐寒性在一定程度上也取决于它们与病原体等生物应激源的相互作用,因而了解低温如何激活昆虫的免疫反应十分必要。目前,相关方面的研究十分有限。M.punctipennis成虫越冬期持续近5个月,利用转录组测序分析发现,低温激活了多种免疫相关基因的差异表达。然而,低温与免疫反应之间的功能关系尚不清楚。本研究旨在从转录水平上回答低温激活甲虫M.punctipennis免疫系统的哪些基因,以及这些免疫相关基因在不同低温条件下的转录水平有何不同,即寒冷如何激活免疫。本研究利用甲虫M.punctipennis低温转录组数据注释和筛选了免疫相关基因并初步绘制了其免疫应答信号通路图,同时利用转录组数据比较了在短时低温胁迫与野外越冬个体之间免疫相关基因表达水平存在的差异,详细分析了两种低温条件下其模式识别受体、免疫信号转导及调控因子和免疫效应因子的转录变化。此外,对低温诱导后表达水平显著上调的抗菌肽基因进行表达和初步的功能分析。主要取得如下结果:(1)基于甲虫M.punctipennis转录组数据挖掘免疫相关基因:甲虫M.punctipennis转录组测序获得198,206个基因,其中共注释49,034个基因,占转录组的24.74%,通过注释信息和手动筛选获得了107个免疫相关基因的1750个同源基因,这些基因主要编码模式识别受体、免疫信号转导及调控因子和免疫效应因子。甲虫M.punctipennis的Toll、MAPK-JNK-p38和JAK-STAT免疫相关通路大多数是完整和保守的;其免疫相关的细胞过程,如自噬、凋亡和RNA干扰基本也是保守的;其具有多种免疫效应物,如抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶、几丁质酶、热休克蛋白和抗氧化酶等。然而,其他昆虫中普遍存在的IMD、FADD和domeless等保守免疫相关基因在M.punctipennis中没有注释到。根据筛选的免疫相关基因初步绘制了M.punctipennis免疫通路图。研究结果为后续分析低温对甲虫M.punctipennis免疫反应的影响提供了基础。(2)转录水平分析低温对甲虫M.punctipennis免疫反应的影响:从转录组水平比较了甲虫M.punctipennis短时低温胁迫组以及野外越冬组与常温对照组之间的差异,详细分析了两种低温条件下其模式识别受体、免疫信号转导及调控因子和免疫效应因子的转录变化。结果表明,在短时低温胁迫(冷驯化),与自然越冬(深度冷适应)条件下,寒冷对甲虫M.punctipennis免疫系统的调节方式不同。越冬甲虫的模式识别受体、丝氨酸蛋白酶等调制因子、Toll和MAPK-JNK-p38信号通路以及细胞自噬过程被激活,IMD和JAK-STAT信号通路以及RNAi和细胞凋亡过程受到抑制,而免疫效应因子抗菌肽、溶菌酶、酚氧化酶、热休克蛋白、几丁质酶、抗氧化酶显著上调。与此不同的是在短时低温胁迫下,甲虫的IMD和JAK-STAT信号通路以及细胞内RNAi过程上调,而酚氧化酶显著下调。越冬低温条件下,甲虫M.punctipennis免疫相关差异表达基因主要参与多细胞有机体过程和肽酶通路,而-4℃短时低温条件下则主要参与胁迫响应过程和外泌体通路。短时低温胁迫和自然越冬条件下,免疫相关基因对低温反应的差异可能与冬季同时存在的其他应激因素,如干燥和饥饿的影响有关。研究结果为后续从生理生化水平上检测低温对甲虫M.punctipennis免疫系统的影响提供了基础。(3)筛选甲虫M.punctipennis的RT-qPCR内参基因并验证其转录组数据:从甲虫M.punctipennis转录组测序数据挑选了5个候选内参基因:延伸因子1α(EF1α),甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH),β肌动蛋白(ACTB)、18S核糖体RNA(18s rRNA)和α-微管蛋白(TUB),使用RT-qPCR技术检测了它们在甲虫M.punctipennis的不同组织、不同发育历期、低温处理不同时间的成虫和幼虫个体中的表达量,通过ΔCt值以及RefFinder、BestKeeper、GeNorm和NormFinder等多种统计方法评估5个候选内参基因的表达稳定性。结果表明,不同发育历期甲虫中稳定性较高的内参基因是EF1α、GAPDH和ACTB,其不同组织中稳定性较高的是EF1α,低温下较稳定的是EF1α和TUB,可在甲虫M.punctipennis中通用的稳定内参基因是EF1α、TUB和ACTB。然后以EF1α、TUB为内参,使用RT-qPCR技术检测了甲虫M.punctipennis的10个基因在低温处理样本中的相对表达量,结果表明其表达规律与低温转录组数据中基本一致。研究结果验证了转录组数据并为甲虫在不同试验条件下选择合适的内参基因提供了参考,有利于后续在甲虫M.punctipennis基因表达研究中获得更加可靠准确的数据。(4)甲虫M.punctipennis差异表达基因Mpattacin的表达及功能初步分析:前期研究发现甲虫M.punctipennis低温转录组中抗菌肽攻击素attacin基因显著上调表达,克隆鉴定了其中2个转录水平高、序列差异大的attacin基因:MpAtt1和MpAtt2,其氨基酸序列具有28.1%的一致性,而核苷酸序列具有38.3%的一致性。二级结构以无规则卷曲和β-折叠为主,三级结构具有高度保守性,具有Attacin_C结构域和Gloverin结构域,属于AttacinC家族,含有N-端信号肽。系统进化树分析显示Mpattacin和其他鞘翅目attacin在进化过程中分歧比双翅目attacin与鳞翅目attacin更早。原核表达纯化融合蛋白MpAtt1和MpAtt2,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性,而对白色念珠菌无抑菌活性。RT-qPCR的结果表明,在4℃与-4℃低温胁迫不同时间后,MpAtt2上调表达的倍数高于MpAtt1,且Mpattacin对4℃低温胁迫表现出更强的响应能力,而在-4℃低温下响应程度较弱,在4℃9 h和-4℃7 h时达到峰值。MpAtt1和MpAtt2在肠道和马氏管内高表达,其中MpAtt1在脂肪体中也高度表达,而4℃处理9 h后,MpAtt2在肠道和马氏管内的mRNA水平显著上升。对低温下大量表达的攻击素Mpattacin的研究表明Mpattacin可能具有低温保护作用。综上所述,本研究构建的荒漠甲虫M.punctipennis免疫信号通路,与模式生物果蝇之间存在一定的差异。不同低温诱导其免疫系统在转录水平发生变化,支持了昆虫的免疫系统可被冷胁迫刺激的假说。其中免疫相关信号通路和细胞过程响应低温的机制与果蝇的也有不同之处,对甲虫M.punctipennis免疫通路的转录激活机理需要进一步在生理水平上进行严格的功能验证。低温下大量表达的MpAttacin蛋白可能在甲虫耐寒性机制中发挥作用,研究结果有助于在甲虫M.punctipennis中发现一些新型的多功能蛋白质。