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Ago（Argonaute）蛋白质是一类广泛存在于真核生物和原核生物的可编程核酸酶。真核生物的Ago（eukaryotic Ago,简称e Ago）蛋白质在RNAi（RNA interference）途径中扮演关键角色,能够使用小RNA作为向导来识别或切割互补的RNA。原核生物的Ago（prokaryotic Ago,简称p Ago）蛋白质不仅可以在体外作为核酸内切酶发挥作用,并且可能在体内参与细胞防御。大多数p Agos与e Agos具有高度的结构同源性,但与e Agos相比,p Agos具有不同的向导和靶标偏好。不同于偏好使用RNA向导（g RNA）的e Agos,大多数已表征的p Agos使用ss DNA（single-stranded DNA）作为向导,只有少数p Agos使用g RNA。e Agos普遍结合与向导互补的RNA靶标,但是大部分p Agos结合与向导互补的DNA靶标。此外,一些p Agos在没有结合向导时也会非特异性切割ds DNA（double-stranded DNA）靶标,这种活性被称作“chopping”活性。一些p Agos能够在DNA向导（g DNA）的引导下切割ds DNA,产生位点特异性DNA双链断裂,并且这种活性不依赖于靶标位点附近的特定基序,理论上可以靶向任意序列的DNA靶标,这使人们产生了将p Agos发展成下一代基因组编辑工具的想法。但在本研究开展之前报道的有催化活性的p Agos几乎都来源于嗜热生物,这些p Agos主要在高温下发挥功能,在20-37℃催化活性低,不太可能适用于中温生物的基因组编辑。中温生物Natronobacterium gregory来源的Ng Ago据称能够在37℃切割ds DNA,是第一个适用于基因组编辑的p Ago。然而,由于无法证明其体外DNA切割活性和在许多真核宿主中重复这些发现,该研究已被撤回。为了找到能够在中温下有效切割核酸靶标的p Agos,并为实现基于p Agos的基因组编辑奠定基础。我们测试了20种中温生物来源的候选p Agos在37℃的切割活性,发现中温细菌马赛库特氏菌（Kurthia massiliensis）来源的Km Ago不仅可以在g DNA的引导下切割ss DNA、ds DNA和RNA,还能在g RNA的引导下切割ss DNA和RNA,可以被认为是一种可编程全能核酸酶,因此对Km Ago的催化机理进行了详细研究。本研究的主要结果如下:1.探究Km Ago靶向ss DNA和RNA靶标的催化机理。（1）Km Ago不仅能够在5’P-g DNA（5’phosphorylated g DNA）的引导下在单个位点切割ss DNA和RNA,还能在5’P-g RNA（5’phosphorylated g RNA）的引导下在单个位点切割ss DNA和RNA。此外,Km Ago还能够在5’OH-g DNA（5’hydroxylated g DNA）的引导下切割ss DNA和RNA,但是对ss DNA的切割发生在多个位点。（2）Km Ago在g DNA引导下的靶标切割活性依赖于Mn2+和Mg2+,并且在Mn2+下的活性更高;在g RNA引导下的靶标切割活性依赖于Mn2+。Km Ago利用不同性质的向导切割靶标的温度范围存在显著差异,在g DNA的引导下最高能在70℃切割靶标,在g RNA的引导下最高能在50℃切割靶标。（3）Km Ago偏爱在5’P-g DNA的引导下切割靶标,能够在5分钟内切割50%以上的ss DNA靶标,在5分钟内切割40%以上的RNA靶标。Km Ago在5’P-g RNA的引导下切割靶标的效率比较低,在5分钟内只能切割不到20%的靶标。（4）Km Ago可以利用短至9 nt（nucleotide）的g DNA高效切割ss DNA和RNA,长度为18 nt的向导介导的切割活性比较高。Km Ago对g DNA的5’-核苷酸没有明显偏爱,对5’-U开头的g RNA有轻微偏爱。Km Ago的活性受向导链和靶标链之间的错配影响,对g DNA和靶标链之间的错配容忍性比较高,对g RNA和靶标链之间的错配容忍性低。（5）Km Ago-g DNAs复合物可以在37℃有效切割高度结构化的RNA。2.探究Km Ago靶向ds DNA靶标的催化机理。Km Ago能够在g DNA的引导下切割质粒DNA,但是在不存在向导时也会非特异性切割质粒DNA。Km Ago可以在g DNA的引导下在37-75℃切割质粒DNA,升高反应温度能够降低Km Ago的非特异性质粒DNA切割活性。Km Ago在结合g DNA后热稳定性显著提高,通过提高g DNA孵育温度使没有结合g DNA的空Km Ago失去活性,能够消除由空Km Ago导致的非特异性质粒DNA切割活性。虽然Km Ago能够在成对g DNAs的引导下在37℃特异性切割GC含量高达53%的质粒DNA区域,但是Km Ago不能在g DNA的引导下切割线性ds DNA。3.探究T7 RNA聚合酶对Km Ago的催化活性的影响。Km Ago能够切割含有7个及以上错配碱基对的ds DNA。考虑到转录过程中ds DNA会被瞬时熔解,出现单链区域,我们测试了T7 RNA聚合酶对Km Ago切割DNA靶标的影响。虽然没有观察到Km Ago在转录体系中切割线性ds DNA的活性,但我们发现T7 RNA聚合酶能够在Km Ago的ss DNA切割产物的末端添加2个核糖核苷酸,并且该活性依赖于Km Ago和ATP。综上所述,Km Ago这种全能活性的发现进一步展示了p Agos的功能多样性,拓展了我们对Ago蛋白质的认识。本研究发现,结合g DNA的Km Ago不仅可以在37℃切割高度结构化和非结构化的RNA,还可以在37℃特异性切割质粒DNA的大部分区域,这为加速开发基于p Agos的RNA和DNA操作工具奠定了基础。此外,本研究发现Km Ago能够辅助T7 RNA聚合酶产生特定的DNA/RNA嵌合链,这让我们对Km Ago和T7 RNA聚合酶的相互作用有了新的认识。