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第一部分pEGFP-N1/TNFR 1载体的构建及鉴定目的:本研究旨在构建人肿瘤坏死因子受体(TNFR 1)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,为研究TNFR 1细胞内转位奠定实验基础。方法:培养U937细胞,提取RNA,RT-PCR扩增出TNFR 1 cDNA基因片段,将TNFR 1基因的RT-PCR纯化产物及质粒pEGFP-N1 DNA经Sac I和Kpn I双酶切、胶回收纯化酶切片段后,体外连接酶切片段,使其定向重组,再将重组DNA转化E. coli DH5α感受态细胞,经复苏后,在含Kanr的LB固体培养基上筛选出阳性克隆。结果:挑取的LB固体培养基上的单菌落经酶切及测序鉴定,证实均为阳性克隆,即TNFR 1与pEGFP-N1体外重组成功。结论:采用体外重组技术,成功地将人TNFR 1 cDNA插入了荧光蛋白表达载体pEGFP-N1中。第二部分重组载体pEGFP-N1/TNFR 1在人脐静脉血管内皮细胞中的表达目的:构建肿瘤坏死因子受体(TNFR 1)绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,并在人脐静脉血管内皮细胞中表达。方法:分离并培养HUVECs,将已成功构建的融合表达载体pEGFP-N1/TNFR 1,通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染到HUVEC中,RT-PCR检测mRNA的表达,Western blot检测融合蛋白的瞬时表达,同时在在活细胞状态下用荧光显微镜直接观察。结果:成功分离人脐静脉血管内皮细胞,重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体转染HUVECs后,在细胞中检测到TNFR 1基因片段,Western blot可以检测到TNFR 1在HUVECs表达,用荧光显微镜观察到转染细胞中有绿色荧光蛋白表达。结论:重组pEGFP-N1/TNFR 1融合表达载体在HUVEC中获得了表达,融合蛋白具有TNFR 1和GFP的双重活性,为进一步研究TNFR转位的调控因素打下基础。第三部分肌球蛋白IIB调节人脐静脉血管内皮细胞肿瘤坏死因子受体1的转位目的:观察非肌肉肌球蛋白IIB(nonmuscle myosin heavy chain IIB,NMHC-IIB)对人脐静脉血管内皮细胞(Human Hmbilical Vein Endothelial Cells, HUVECs)中肿瘤坏死因子受体1(TNF receptor 1, TNFR 1)转位的影响。方法:将成功构建的重组pEGFP-N1/TNFR 1载体通过阳离子脂质体Lipofectin介导的方法转染入HUVECs,筛选获得稳定克隆株。设计并合成NMHC-IIB的小分子干扰RNA(small interference RNA,siRNA),用脂质体LipofectamineTM 2000转染进入该稳定克隆株,差速离心加蔗糖密度梯度离心收获细胞质膜,Western印迹法观察TNFα诱导前和诱导后细胞质膜上TNFR 1蛋白含量的变化。结果:与空白对照组比较,转染NMHC-IIB siRNA进入HUVECs,可以明显抑制细胞内NMHC-IIB mRNA的表达(0.4540±0.0411 vs. 0.6704±0.0242,P < 0.001),也可以明显减少TNFα诱导前和诱导后细胞质膜TNFR 1的含量(0.3248±0.0167 vs. 0.4306±0.0289,P < 0.01;0.4922±0.0217 vs. 0.6609±0.0265,P < 0.001)。然而,在转染NMHC-IIB siRNA的细胞,TNFα的诱导仍然可以提高细胞质膜TNFR 1的含量(0.4922±0.0217 vs. 0.3248±0.0167,P < 0.001)。结论:NMHC-IIB可能在TNFR 1从反式高尔基体到细胞质膜的转位或运输中起正向作用,但是可能并不是惟一的,或者决定性的因素。