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基因突变所致的生长失调导致肿瘤细胞无限增生。同时,由于血供不足,肿瘤细胞通常处于一种缺氧和营养缺乏的环境中。理论上,有两种相互关联又相互独立的方法来应付氧供缺乏和营养不足的局面:一种是增加供应,这一观点为大家广为接受。另一种是忍受这种环境,励行节约。肿瘤生长的需求往往超出其通过血管生成来改善自身的氧和营养的供应,这也许就是肿瘤生长过程中经常伴随着坏死灶形成的原因。只有在不利的微环境中仍能生存下去的细胞才能称为恶性细胞。胰腺癌就是一种乏血供的肿瘤,同时也是最具侵袭力的肿瘤之一。胰腺癌就诊时多已发生浸润转移,根治手术切除率低,治疗效果不佳,对胰腺癌细胞生存和浸润转移机制的研究,可望找到解决这一问题的方法,提高胰腺癌临床治疗效果。在王春友教授的指导下,本课题组拟研究在细胞生长代谢过程中起重要作用的蛋白AKT2与HIF-1α在胰腺癌组织中的表达及其作用机制,研究体外模拟低氧低营养环境下胰腺癌细胞AKT2与HIF-1α蛋白表达变化,用RNAi的方法阻断AKT2基因的表达对胰腺癌细胞生物学行为的影响,为胰腺癌细胞生存、浸润转移机制和基因治疗提供新的理论基础和实验依据。第一部分AKT2与HIF-1α在胰腺癌中的表达及其临床意义目的探讨胰腺癌组织中丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2(AKT2)、HIF-1α蛋白的表达及其临床意义。方法应用免疫组化SABC法检测63例胰腺癌组织和23例胰腺良性病变组织中AKT2、HIF-1α蛋白的表达,分析其与胰腺癌临床病理因素的关系。结果AKT2、HIF-1α蛋白在胰腺癌组织中的阳性表达率分别为39.7%(25/63)、63.5%(40/63),明显高于胰腺良性病变组的13%(3/23)、17.4%(4/23)(P<0.05)。AKT2表达与HIF-1α表达呈正相关(P<0.05)。AKT2表达与组织学分级、淋巴结转移、TNM分期有关(P<0.05),而与患者的性别、年龄、胰腺癌大小无关(P>0.05)。结论AKT2和HIF-1α在胰腺癌组织中表达增高,AKT2可能通过调节HIF-1α表达来影响胰腺癌的发生、发展、转移。第二部分胰腺癌细胞在低氧低营养状态下的生长特性及AKT2对HIF-1α的调节作用目的探讨胰腺癌细胞在低氧低营养状态下的生长特性及在此条件下AKT2对HIF-1α的调节作用,为胰腺肿瘤治疗寻找有效靶点。方法在低氧低营养状态下培养胰腺癌细胞株PANCl和肝癌细胞株HepG2。用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制胰腺癌细胞PANCl在低氧低营养状态下的生长曲线。在用P13K抑制剂LY294002处理胰腺癌细胞株PANCl前后,用RT-PCR和免疫印记技术(Western Blot)检测细胞中AKT2、HIF-1α的mRNA和蛋白质表达水平的变化。结果在低氧低营养状态下胰腺癌细胞PANCl的耐受性明显高于肝癌细胞HepG2。低氧低营养状态可以激活P13K/AKT2信号通路,诱导HIF-1α蛋白表达。用P13K抑制剂LY294002可阻断低氧低营养状态对P13K/AKT2信号通路的激活,使HIF-1α蛋白水平降低。结论在胰腺癌细胞中低氧低营养状态可通过AKT2的激活调节HIF-1α的表达。第三部分针对AKT2基因的短发夹状RNA表达载体构建及鉴定目的构建及鉴定针对AKT2基因的短发夹状RNA表达载体,研究shRNA对PANCl细胞中AKT2表达的影响,为探讨RNA干扰作用及机制提供实验资料。方法设计、合成针对AKT2基因的特异性shRNA模板序列,将其连接入含U6启动子的pSIREN-DNR-DsRed-Express载体,得到针对AKT2 shRNA表达载体pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2,并进行酶切和测序鉴定,然后在脂质体介导下转染PANC1细胞,检测转染效率。应用RT-PCR检测其对AKT2基因表达的影响。结果经酶切和测序证明成功构建了AKT2基因siRNA真核表达载体;转染24h转染效率可达61%;短发夹状RNA在PANCl细胞中能诱导RNA干扰(RNAi),序列特异的导致AKT2 mRNA降解,与空白对照组、阴性对照组细胞相比,转染pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2质粒的细胞AKT2基因表达水平明显降低(P<0.01)。结论本实验已成功构建针对AKT2基因的shRNA真核表达载体,通过其发挥RNAi作用在PANCl细胞中有效抑制了靶基因的表达,为下一步实验奠定了基础。第四部分AKT2短发夹状RNA对胰腺癌细胞生物学行为的影响目的研究针对AKT2短发夹状RNA对AKT2蛋白的抑制作用,探讨针对AKT2短发夹状RNA对胰腺癌细胞PANCl增殖和凋亡的调控作用。方法应用免疫印记技术(Western Blot)检测转染AKT2 shRNA表达载体后胰腺癌细胞PANCl/pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2 (实验组)、PANCl/pSIREN-DNR-DsRed-Express-NC(阴性对照组)和PANCl(空白对照组)的AKT2蛋白质表达水平的变化;四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法绘制细胞生长曲线;hoechst33258染色、流式细胞技术检测转染AKT2 shRNA表达载体后胰腺癌细胞株PANCl 的凋亡情况。 结果 重组质粒pSIREN-DNR-DsRed-Express-AKT2转录生成的shRNA明显抑制了胰腺癌细胞株PANCl的AKT2蛋白质表达:转染组细胞生长明显缓慢,出现部分凋亡细胞,与对照组细胞相比有显著性差异(P<0.05)。 结论针对AKT2短发夹状RNA能有效抑制胰腺癌细胞PANCl中AKT2表达,抑制细胞生长,诱导细胞凋亡,为胰腺癌的治疗提供新思路。