雌激素在激素依赖性乳腺癌的进展和转移中起重要作用。雌激素主要通过雌激素受体α(Estrogen receptorα,ERα)和β(Estrogen receptorβ,ERβ)发挥作用。ERα在乳腺癌中的作用已被广泛研究,对促进乳腺癌的发生发展起重要作用。ERα是目前乳腺癌内分泌治疗的主要靶标。ERβ是第二个发现的雌激素受体,与ERα具有相同的结构域,但其功能与ERα并不完全相同。ERβ在乳腺癌中的作用目前尚不明确。尽管一些研究表明ERβ促进乳腺癌的侵袭和转移,表达高水平ERβ的乳腺癌患者预后不良,但大多数研究认为ERβ是一种乳腺癌抑制基因。ERβ在乳腺上皮组织中具有较高的表达水平,随着肿瘤的进展过程其表达水平降低,体外实验表明ERβ的表达能够抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。然而,ERβ对乳腺癌抑制作用的分子机制尚有待进一步研究。最近有研究报道,ERβ通过诱导自噬抑制乳腺癌细胞增殖。自噬在维持细胞内环境平衡中起关键作用。自噬的失调与肿瘤有关。研究表明,ERβ的激活可以诱导自噬,导致细胞周期阻滞,从而抑制肿瘤细胞增殖。在胶质母细胞瘤细胞中,自噬相关蛋白beclin1、atg5或atg7表达缺失导致自噬减少,进而通过上皮-间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)促进细胞的迁移和侵袭。然而,关于ERβ对乳腺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用与自噬的关系却鲜见报道。此外,ERβ诱导自噬的调控机制尚不清楚。我们前期研究发现,CLDN6诱导乳腺癌细胞自噬。但是,关于CLDN6在ERβ诱导的自噬中的作用未见报道。Claudin6(CLDN6)是一种紧密连接(tight junction,TJ)蛋白。作为TJs的重要组成部分,CLDNs不仅发挥经典的屏障和栅栏功能,而且对细胞通讯和信号的调节起重要作用。课题组一直从事CLDN6在乳腺癌中的作用的研究工作。我们认为CLDN6是一种乳腺癌抑制基因,已报道CLDN6诱导乳腺癌细胞凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力。前期工作中,我们发现,17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)上调CLDN6的表达,抑制MCF-7细胞的迁移和侵袭,但其分子机制尚不清楚。在本研究中,我们发现E2在ERα表达阳性的MCF-7和ERα表达阴性的MDA-MB-231细胞中均能上调CLDN6的表达,抑制肿瘤细胞的迁移和侵袭。因此,我们认为这种E2诱导效应不依赖于ERα起作用。由于两种乳腺癌细胞中均表达ERβ,因此,我们推测ERβ可能对CLDN6在乳腺癌细胞中的表达起重要调控作用,其可能的机制是ERβ通过CLDN6诱导自噬进而影响乳腺癌细胞的迁移和侵袭。本研究旨在探讨ERβ对乳腺癌细胞CLDN6表达的调控作用及ERβ诱导的自噬与抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭的相关机制,为ERβ和CLDN6作为乳腺癌抑制基因的机制研究及潜在的乳腺癌治疗靶点提供理论和实验依据。方法:1.ERβ对CLDN6表达的调控作用及机制(1)雌激素对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控作用E2处理MCF-7(ERα+/ERβ+/GPR30+)、MDA-MB-231(ERα-/ERβ+/GPR30-)和SK-BR-3(ERα-/ERβ-/GPR30+)细胞,RT-PCR和Western Blot检测CLDN6、ERα和ERβ的表达;ERs拮抗剂ICI 182780(ICI)联合E2处理MCF-7和MDA-MB-231细胞,q RT-PCR和Western Blot检测CLDN6的表达;划痕和Transwell实验检测E2对MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭作用。(2)ERβ对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控作用ERβ的特异性激活剂Diarylpropionitrile(DPN)处理MDA-MB-231细胞,RT-PCR和Western Blot检测CLDN6的表达;免疫荧光检测CLDN6的表达和定位;透射电镜检测细胞间紧密连接;利用RNA干扰技术沉默DPN处理的细胞中的CLDN6,划痕和Transwell实验检测细胞的迁移和侵袭能力。通过转染ERβ质粒获得稳定过表达ERβ的细胞株,Western Blot检测DPN处理的ERβ过表达的细胞中CLDN6的表达;利用ERβ特异性拮抗剂PHTPP和RNA干扰技术使ERβ表达缺失,Western Blot检测DPN处理的ERβ缺失的细胞中CLDN6的表达。(3)ERβ对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控机制Western Blot和免疫荧光检测DPN处理的细胞中ERβ的表达和定位;Ch IP实验检测ERβ和Sp1与CLDN6启动子区的结合情况;双荧光素酶报告基因实验检测ERβ对CLDN6启动子区活性的影响。2.ERβ诱导乳腺癌细胞自噬的作用及机制(1)ERβ对乳腺癌细胞自噬的诱导作用透射电镜、免疫荧光和Western Blot检测DPN激活的ERβ对乳腺癌细胞自噬的影响;Western Blot和免疫荧光检测沉默ERβ的DPN处理的细胞中LC3B的表达;自噬抑制剂(CQ或3-MA)联合DPN处理细胞,Western Blot检测LC3B的表达,划痕和Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力。(2)ERβ诱导乳腺癌细胞自噬的作用机制Western Blot检测DPN处理的细胞中,自噬标志蛋白的表达;利用RNA干扰技术沉默DPN处理的细胞中的CLDN6,Western Blot检测自噬标志蛋白的表达;利用RNA干扰技术沉默DPN处理的细胞中的beclin1,Western Blot检测自噬标志蛋白的表达;通过转染CLDN6质粒获得稳定过表达CLDN6的细胞株,Western Blot检测自噬标志蛋白的表达;利用RNA干扰技术沉默过表达CLDN6细胞中的beclin1,Western Blot检测自噬标志蛋白的表达;划痕和Transwell实验检测CLDN6/beclin1对乳腺癌细胞迁移及侵袭的影响。通过小鼠尾静脉注射,建立裸鼠乳腺癌肺转移模型,检测CLDN6/beclin1对乳腺癌转移的影响;Western Blot检测DPN处理的和过表达CLDN6的细胞中ZO-1和UVRAG的表达;Co-IP实验检测UVRAG与ZO-1、beclin1和CLDN6的结合情况以及ZO-1与UVRAG、beclin1和CLDN6的结合情况。3.人乳腺癌组织中ERβ、CLDN6和beclin1的表达及其与预后的关系免疫组织化学技术检测人乳腺癌组织中ERβ、CLDN6和beclin1的表达,分析ERβ、CLDN6和beclin1的表达与临床病理参数的关系以及ERβ、CLDN6和beclin1表达之间的关系;Kaplan-Meier plotter数据库分析ERβ、CLDN6和beclin1与总生存期(overall survival,OS)和无病生存期(disease free survival,DFS)的关系。结果:1.ERβ对CLDN6表达的调控作用及机制(1)雌激素对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控作用E2上调MCF-7和MDA-MB-231细胞中CLDN6的m RNA和蛋白表达水平,SK-BR-3细胞中CLDN6的m RNA和蛋白表达水平在E2的作用下无变化;与E2单独处理组相比,E2联合ICI处理组细胞中CLDN6表达减少;与未处理组相比,E2处理的MCF-7细胞中ERα表达无变化,E2处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞中ERβ表达升高;与未处理组相比,E2处理的MCF-7和MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭能力降低。以上结果表明,E2通过ERβ调控CLDN6的表达。(2)ERβ对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控作用DPN上调MDA-MB-231细胞中CLDN6的m RNA和蛋白表达水平;与未处理组相比,DPN处理的细胞中,CLDN6在细胞膜上的表达增多,细胞间紧密连接增强;与未处理组相比,DPN处理组细胞的迁移及侵袭能力降低;与DPN处理的空载组相比,DPN处理的沉默CLDN6的细胞迁移及侵袭能力增加;与DPN处理的空载组相比,DPN处理的ERβ过表达的SK-BR-3和MDA-B-231细胞中CLDN6的表达增加;与对照组相比,DPN处理的ERβ缺失的细胞中CLDN6的表达减少。以上结果进一步表明,DPN激活的ERβ正向调控CLDN6的表达。(3)ERβ对乳腺癌细胞中CLDN6表达的调控机制与未处理组相比,DPN处理的细胞中,ERβ在细胞核的表达增多,在细胞浆的表达减少;ERβ和Sp1均可以与CLDN6启动子区结合;与p GL3-CLDN6组细胞相比,DPN处理的p GL3-CLDN6组细胞的荧光活性增强。以上结果表明,ERβ在转录水平调控CLDN6的表达,CLDN6是ERβ的靶基因。2.ERβ诱导乳腺癌细胞自噬的作用及机制(1)ERβ对乳腺癌细胞自噬的诱导作用与未处理组相比,电镜观察发现DPN处理组细胞自噬泡增多,免疫荧光观察发现DPN处理组细胞LC3B标记的斑点数量增多,Western Blot结果发现LC3II与LC3I的比值增加;与DPN处理的空载组相比,DPN处理ERβ缺失的细胞中,LC3II与LC3I的比值减少,LC3B标记的斑点数量减少;CQ与DPN联合处理组细胞的LC3II/LC3I比值高于DPN单独处理组,3-MA与DPN联合处理组细胞的LC3II/LC3I比值低于DPN单独处理组;DPN联合3-MA处理组细胞的迁移及侵袭能力高于DPN单独处理组。以上结果表明,ERβ参与自噬体形成的早期阶段,ERβ诱导的自噬抑制乳腺癌细胞的迁移及侵袭。(2)ERβ诱导乳腺癌细胞自噬的作用机制与未处理组相比,DPN处理的细胞中自噬标志蛋白beclin1、atg5、atg16和LC3II的表达增加;与DPN处理的空载组相比,沉默CLDN6或沉默beclin1的DPN处理的细胞中自噬标志蛋白beclin1、atg5、atg16和LC3II的表达减少;与空载组相比,过表达CLDN6的细胞中自噬标志蛋白beclin1、atg5、atg16和LC3II的表达增加;与空载组相比,沉默beclin1的CLDN6过表达的细胞中自噬标志蛋白beclin1、atg5、atg16和LC3II的表达减少;与未处理组相比,DPN处理组细胞的迁移及侵袭能力降低,与DPN处理的空载组相比,沉默beclin1的DPN处理组细胞的迁移及侵袭能力增强;与空载组相比,CLDN6过表达组细胞的迁移及侵袭能力降低,与CLDN6过表达组相比,沉默beclin1的CLDN6过表达组细胞的迁移及侵袭能力增强;与空载组相比,过表达CLDN6组小鼠乳腺癌肺转移数目减少,与过表达CLDN6组相比,沉默beclin1的CLDN6过表达组小鼠乳腺癌肺转移数目增多;DPN处理的和过表达CLDN6的细胞中ZO-1和UVRAG的表达高于各自对照组;Co-IP结果发现,UVRAG能够分别与ZO-1、beclin1和CLDN6结合,ZO-1能够分别与UVRAG、beclin1和CLDN6结合。以上结果表明,CLDN6/beclin1介导的自噬抑制乳腺癌细胞的转移;CLDN6与ZO-1/UVRAG/beclin1组成复合物招募其他自噬相关蛋白参与自噬体的形成。3.人乳腺癌组织中ERβ、CLDN6和beclin1的表达及其与预后的关系人乳腺癌组织中,ERβ定位在细胞质和细胞核,CLDN6定位在细胞质和细胞质膜,beclin1主要定位在细胞质;ERβ与TNM分期有关,beclin1与肿瘤体积大小有关。ERβ、CLDN6和beclin1与患者年龄、淋巴结转移以及病理分级无关;在人乳腺癌组织中,ERβ与CLDN6表达呈正相关,CLDN6与beclin1的表达呈正相关;beclin1表达高的乳腺癌患者比beclin1表达低的患者OS长,ERβ、CLDN6和beclin1表达高的乳腺癌患者比各自表达低的患者DFS长。以上结果表明,ERβ、CLDN6和beclin1表达高的乳腺癌患者预后较好。结论:1.CLDN6是ERβ的靶基因。2.ERβ通过CLDN6/beclin1介导的自噬抑制乳腺癌细胞迁移及侵袭。3.ERβ、CLDN6和beclin1表达高的乳腺癌患者预后较好。