论文部分内容阅读
目的：①建立高表达microRNA-122的肝癌细胞模型,研究microRNA-122对肝癌细胞的影响及OSW-1对此细胞模型的作用影响。②研究OSW-1对肝癌细胞microRNA水平的影响。③探索OSW-1在过表达microRNA-122的Hep3B-miR-122肝癌细胞的凋亡和增殖活性、基因表达谱和Wnt信号通路相关基因调控表达的影响。④研究OSW-1的抗肿瘤机制和进一步揭示microRNA-122的生物学功能并寻找OSW-1的靶向作用基因。方法：①体外建造含有microRNA-122前体序列的重组质粒pSIREN-miR-122,并将其成功转染入Hep3B细胞中,筛选出稳定高表达microRNA-122的单克隆细胞株,并使用荧光实时定量PCR和双荧光素酶报告系统验证构建的细胞株。②将Hep3B细胞分设成4组：(A)阴性对照组;(B)OSW-1组；(C)阿霉素组；(D)OSW-1与阿霉素联合用药组。利用LNATM microRNA微阵列芯片技术检测这四组的人类全microRNA基因组的表达情况。③将稳定高表达microRNA-122的Hep3B-miR-122细胞分设2组：(A)阴性对照组；(B)OSW-1组。使用Roche-NimbleGen全基因组表达谱芯片检测全基因的表达,并通过GO分析和patway分析其具体的表达情况。④通过WST-8法Cell Counting Ki-8检测试剂细胞增殖和毒性检测,绘制Hep3B细胞和Hep3B-miR-122细胞的生长曲线和在OSW-1和阿霉素等作用下的凋亡曲线。⑤通过投射电镜和共聚焦显微镜技术对Hep3B细胞和Hep3B-miR-122与经过OSW-1作用后的两组细胞进行比对,观察其形态学变化。结果：①成功构建了pSIREN-miR-122重组质粒和稳定高表达microRNA-122的Hep3B-miR-122单克隆细胞株。②OSW-1作用于Hep3B细胞后,hsa-mir-299-5p、has-miR-1908、 has-miR-125b-1-3p、has-miR-187a-5p、has-miR-1275、hav1-miR-H6-3p、 ebv-miR-BHRF1-2、has-miR-181a-5p、has-miR-210、has-mir-483-3P等表达上调；hsa-miR-126-3p和hsa-miR-208a等表达下调。OSW-1在阿霉素的联合作用下使得Hep3B细胞中的has-miR-142-3p、miR-200c-3p等表达上调。以上microRNA与肿瘤的增殖、凋亡、侵袭力和转移性有密切联系。③OSW-1可影响MAPK、WNT、Hedegehog、AXON、VEGF、FOCAL、Adherens Junction、P53等通路中的众多基因的表达,其中包括Ras、c-JUN、c-Myc、CyclinD和Bcl-2等癌基因和CytC、Caspase-3、8、9等抑癌基因。④Hep3B-miR-122组的增殖速率低于Hep3B组(P<0.01)。OSW-1和阿霉素可抑制Hep3B细胞的增殖,Hep3B-miR-122较Hep3B相比其受肿瘤药物的抑制作用更加明显。⑤microRNA-122可使细胞核质比增大,线粒体增大,线粒体脊结构消失,OSW-1使细胞和线粒体固缩。结论：①OSW-1可以调节众多与增殖分化、凋亡、细胞粘附、侵袭力等相关microRNA的表达。②OSW-1可以抑制肿瘤细胞的增殖速率,促进凋亡,保持肿瘤细胞粘附性,保持细胞极性,降低肿瘤细胞的迁徙和转移能力,microRNA-122对抗肿瘤有促进作用。③microRNA-122具有抑制Hep3B细胞的体外增殖、促进凋亡、促使细胞核增大、线粒体增大,线粒体脊结构消失并增加对肿瘤药物的敏感性。