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目的 本实验设计通用引物扩增龈下菌斑全细菌16S rDNA片段，通过变性梯度凝胶电泳得到龈下菌群DNA图谱，动态观察龈下细菌治疗前后在口腔内定植的变化，为牙周病病因学的研究和临床治疗方案的确定提供实验依据。 方法 1．标本选择：龈下菌斑取自中国医科大学口腔医学院牙周病门诊成人牙周炎患者。实验对象选择年龄在30-55周岁之间、探诊深度3-6毫米、无全身系统疾病、未接受过牙周治疗、近两个月未服用任何抗生素和甾体类药物者，共26例。 2．治疗随访计划：患者首次就诊，以治疗前牙周状态为基线，取龈下菌斑；记录菌斑指数(Plaque Index，PlI)、牙龈出血指数(Bleeding On Probing，BOP)、牙齿松动度和牙槽骨吸收度，测量探诊深度(Probing Depth，PD)；进行全口龈上洁治、龈下刮治、根面平整，嘱患者口服甲硝唑(200mg，TID)7天。治疗后一周、一个月和三个月时复查，取龈下菌斑，记录牙周临床指标。 3．标本采集：刮匙法。每个实验对象选取探诊深度在3-6mm之间的一颗牙齿作为研究对象，龈下刮治器刮取牙周袋的近中、远中、颊侧牙根面和软组织面各一下，置入含0.5ml无菌PBS溶液的Eppendorf管中，-70℃深冻冰箱保存。 4．统计学分析：应用SPSS11.0软件分析牙周临床指标在治疗前后是否有差异及相关性。 5．龈下菌斑DNA的提取及浓度测定：酚-氯仿法提取龈下菌斑全细菌 DNA，溶于 60 pl h。取 5 gi测量 DNA纯度及浓度，其余置一20℃冰箱保存。紫外分光光度仪分别测量260urn和280urn处吸光度值及比值。比值界于1．7－2．0之间，表示DNA纯度较好。按公式：DNA浓度（p砂…）＝（A删 x 50 x稀释倍数＊1000，对DNA进行定量分析。 6．PCR扩增：165 rDNA通用引物扩增全细菌 16s rDNA序列。设计含GC夹的引物，使扩增后的PCR产物在浓度递增的变性梯度凝胶中始终保持分叉状结构。豆％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。 7．变性梯度凝胶电泳（DGGE）观察龈下菌群DNA图谱。 7．1 垂直DGGE：制备0－100％垂直变性梯度凝胶，检测最适解链条件门变性浓度人 7．2 平行DGGE：根据垂直DGGE检测到的解链区域变性浓度，制备相应变性范围的平行梯度凝胶。动态观察治疗前后龈下菌群DNA图谱。 7．3 选择特异条带进行切胶、测序分析：选择治疗后减弱J失的两个DNA条带和治疗后新出现的两个条带，切胶、回收、克隆、纯化、测序。 结 果 二．牙周基础治疗前后临床指标的变化 1．126例成人牙周炎患者经牙周基础治疗后，临床症状明显改善，牙周临床指标均有下降。统计学分析表明 PllJOP、PD和牙齿松动度在治疗前后具有明显差异仔＜o．0U。牙槽骨吸收度在治疗前后变化不明显，无统计学意义。龈下全细菌DNA浓度有下降趋势，这种差异不具有统计学意义。 1．2 Speannan相关分析表明BOP与PD具有重度正相关关 ·2·系h二O．71o，P＜0．01人随着＊D的降低，BOP指数减少；牙齿松动度与牙槽骨吸收度和 PD呈中重度正相关关系卜二 0．630刀．526，P＜o．01人随着牙槽骨吸收度和PD的减少，牙齿松动度降低。 2．DGGE图像分析 变性梯度凝胶电泳成功地得到龈下菌群DNA图谱，可动态观察龈下菌群在基础治疗前后的变化：治疗后一个月DNA图谱变化明显，新带出现；治疗后三个月与治疗前在一定程度上相似。 3．测序结果 选取治疗前明显、治疗后减弱、消失的两个DNA条带，切胶、回收、克隆、纯化、测序。测序结果经GenBank的BLAST分析，表明它们的碱基序列与牙龈叶琳单胞菌（PorPhyromonas gingivnglis，Pg）的 16s rDNA序列片段有98％和99％的同源性；选择治疗后新出现的两个条带同上处理，结果表明它们的碱基序列与叶琳菌属 od clone cd34（po叩岭romonas sp．oral clone cM34）有99畅的同源性。 结 论 1．成人牙周炎患者牙周基础治疗后，临床症状明显改善。菌斑指数、牙龈出血指数、牙齿松动度和探诊深度在治疗前后具有明显差异瞩＜0．01人牙槽骨吸收度在治疗前后变化不明显，无统计学意义。 2．Spearman相关分析表明BOP与PD具有重度正相关关系（r＝o．＊0，P＜o．01），随着＊D的降低，＊OP指数减少；牙齿松动度与牙槽骨吸收度和 PD呈中重度正相关关系卜一0．630刀．526，P＜0．01L随着牙槽骨吸收度和＊D的减少，牙齿松动度降低。 3．龈下菌斑DNA浓度治疗前后变化不明显，无统计学意义， ·3·表明治疗后龈下菌群量无明显变化。DGGE胶的龈下菌群DNA图谱显示，治疗后龈下细菌种类和比例发生改变，即龈下菌群构成比发生变化。 4．测序结果进一步证实 Pg是成人牙周炎重要可疑致病菌，治疗前大量的存在于龈下菌斑，治疗后分布减少，甚至检测不到。 5．DGGE成功地得到龈下菌群DNA图谱，可以动态观察龈下菌群组成变化?