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目的:以VEGF为切入点,在动物和细胞实验探讨肾康注射液对UUO小鼠肾纤维化和HUVEC血管生成的调控作用及作用机制。方法:1.动物实验:将雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组(sham)、单侧输尿管梗阻组(UUO)、氯沙坦钾组(ARB)及高、中、低剂量肾康组(SKI-H、SKI-M、SKI-L)。除sham组外的各组行UUO手术;次日ARB组予氯沙坦钾(13 mg/kg·d)灌胃;SK]-H、SKI-M、SKI-L 组分别予 7.8 g/kg·d、3.9 g/kg·d、1.95 g/kg·d SKI 尾静脉注射。观察小鼠一般状态、记录体重变化。给药14天后检测血Scr、BUN、CysC水平;micro-CT检测肾脏血管分布;HE染色观察肾组织形态改变;天狼星红染色观察胶原沉积;IHC染色观察VEGF、VEGFR-2表达。2.细胞实验:将HUVEC分为空白组(CON)、SKI高剂量组(SKI-11)、SKI-低剂量组(SKI-L)、VE GF 沉默组(Si)、VEGF 沉默-SKI 高剂量组(Si-SKI-H)、VEGF 沉默-SKI 低剂量组(Si-SKI-L)。SKI-H、SKI-L 组分别予 8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预 24 h;Si组通过RNAi转染沉默VEGF基因;Si-SKI-H、Si-SKI-L组在转染同时分别予8 mg/ml、2 mg/ml SKI干预24 h。观察血管生成情况,计算血管生成参数;real-time PCR和western blot法分别检测VEGF通路重要靶点基因和蛋白表达。结果:1.动物实验:给药14天后UUO组体重较sham组减轻(P<0.01);ARB、SKI-H、SKI-M组体重较UUO组增高(P<0.05)。UUO组Scr、BUN、CysC水平较sham组升高(P<0.05,P<0.01);ARB、SKI-H 组 Scr、BUN、CysC 水平较 UUO 组降低(P<0.05,P<0.01)。肉眼观察sham组双肾无明显异常改变;UUO组患侧肾脏表面粗糙、膨大、积水,肾盂肾盏扩张,实质变薄;SKI组患肾结构破坏较UUO组减轻。micro-CT见sham组肾血管密集,走向清晰;UUO组患肾血管疏松,分支减少、曲度下降;SKI组患肾血管损伤较UUO组减轻。HE染色见sham组肾脏结构完整,无明显病理损害;UUO组肾小管扩张,上皮细胞肿胀坏死,间质增宽伴炎性浸润;SKI组肾脏损伤较UUO组减轻。天狼星红染色(光镜)见sham组肾脏几乎无红染胶原;UUO组肾间质大量红色胶原聚集;SKI组红染程度较UUO组减轻。偏振光镜荧光信号变化与普通光镜所见大体一致。IHC示UUO组患肾VEGF、VEGFR-2表达较sham组降低(P<0.01);SKI 组 VEGF、VEGFR-2 表达较 UUO 组降低(P<0.01)。剂量方面,SKI 减轻肾脏纤维化损伤和促进血管生成,以中、高剂量效果更优。2.细胞实验:沉默VEGF 24 h后Si组VEGF基因表达较CON组显著降低(P<0.01),阴性对照组与CON组VEGF无显著差异(P>0.05),验证转染稳定可行。血管生成方面,SKI组血管连接较CON组增多、血管网密度增大,血管生成参数提高,SKI促进HUVEC血管生成(P<0.01,P<0.05)。基因表达方面,与CON组相比,SKI-H 组 VEGF、VEGFR-2、eNOS 水平升高(P<0.05,P<0.01);与 Si 组相比,Si-SKI-H 和 Si-SKI-L 组 VEGF、eNOS 水平升高(P<0.05,P
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