牛支原体是感染牛的一种致病性病原菌,由该病原引发的相关疾病给养牛业带来了巨大的经济损失。流行病学调查显示,牛支原体感染率逐年上升,而临床治疗中抗生素效果差,疫苗是预防及治疗M.bovis相关疾病有效方法,牛支原体疫苗的研制迫在眉睫。研究中发现,通过体外连续传代,可以使牛支原体单位体积培养液所含活菌数发生数量级的改变。此过程中,牛支原体蛋白表达水平发生着怎样的变化,如果一些重要的保护性抗原丢失,将导致免疫保护力下降。本研究采用iTRAQ、Western blot和荧光定量PCR方法,对牛支原体不同代次菌株总蛋白表达水平进行了分析,在保证重要的免疫保护性抗原稳定表达的前提下,筛选出单位体积内活菌数量最多的代次,制备灭活疫苗,进行初步临床试验。主要的研究结果如下:1.本研究针对呼和浩特市周边地区规模化养牛场进行了3年的牛支原体感染情况调查,发现近几年牛支原体血清阳性率逐年上升,感染率高达90%。通过对多株菌16S rDNA序列进行进化分析,发现本实验室分离株NM-28,NM-40,NM-42与数据库中收录的其他地区代表株进化距离近,即我国牛支原体流行株相对保守。2.测定了牛支原体NM-28分离株7个代次的生长曲线,结果表明,随着代次的增加,单位体积内活菌数增加,且进入平台期所需的时间明显缩短。120代及以后代次的活菌数可达1011 cfu/mL,且24 h就进入了平台期,而其它4个代次进入平台期需要30h,活菌数最高只达1010 cfu/mL。牛支原体NM-28分离株可以通过体外连续传代,提高单位体积内活菌数,且呈数量级倍数增长。3.运用iTRAQ蛋白组学技术研究了牛支原体NM-28菌株第3代和第60代蛋白表达差异。经生物信息学分析,差异蛋白主要与生长代谢、蛋白合成和核糖体构成有关。牛支原体具有免疫原性相关的膜蛋白,在第3代和第60代中的表达水平差异不显著。4.为了对牛支原体进行深入研究,根据蛋白组学结果,筛选出P81、P48、EF-Tu、2个膜蛋白和1个脂蛋白进行原核表达。Western blot分析表明,重组蛋白可特异性与牛支原体标准阳性血清结合,具有反应原性。将重组蛋白免疫新西兰兔,得到以上6种蛋白的高免血清。5.利用荧光定量PCR,研究了 15个蛋白mRNA在不同代次中的表达水平,结果表明,NM-28-F120与NM-28-F3蛋白表达水平基本一致。通过Westem blot,研究以上6个蛋白在牛支原体NM-28菌株不同代次中的表达水平,所有代次中均有表达且表达水平差异不显著。结合生长曲线测定结果,理论上认为120代次及以上代次,既保证了免疫效果,也可以降低灭活疫苗的生产成本。6.通过临床试验,牛支原体NM-28-F120和NN-28-F150灭活疫苗既可诱导机体产生免疫应答,也可免疫感染犊牛,降低感染率和发病率。二者在统计上没有显著差异。考虑到成本等因素,NM-28-F120为疫苗株的最佳代次。