【摘 要】
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目的:本研究拟采用CRISPR/Cas9基因治疗和微针（MN）贴片相结合的方法,制备基底具有良好导电性能、尖端可溶且载有质粒的双层电转MN,并对其进行表征;然后对人舌鳞癌荷瘤免疫缺陷动物模型进行在体基因的电转染实验,实现PLK1基因的靶向敲除,通过宏观观察、组织化学、免疫组织化学、分子生物学等分析方法来评价抑瘤效果,为皮下肿瘤的临床治疗提供一定的思路。方法:（1）CRISPR/Cas9表达质粒的构
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目的:本研究拟采用CRISPR/Cas9基因治疗和微针（MN）贴片相结合的方法,制备基底具有良好导电性能、尖端可溶且载有质粒的双层电转MN,并对其进行表征;然后对人舌鳞癌荷瘤免疫缺陷动物模型进行在体基因的电转染实验,实现PLK1基因的靶向敲除,通过宏观观察、组织化学、免疫组织化学、分子生物学等分析方法来评价抑瘤效果,为皮下肿瘤的临床治疗提供一定的思路。方法:（1）CRISPR/Cas9表达质粒的构建和提取:构建三种敲除PLK1的CRISPR/Cas9质粒,对含质粒的Stbl3感受态细胞使用碱裂解法,进行质粒的提取和扩增。（2）双层电转MN的制备及表征:首先采用化学氧化法合成了导电性良好且在水中具有良好分散性能的多巴胺改性的聚吡咯（DA-PPy）并进行扫描电镜（SEM）和傅里叶红外光谱（FT-IR）表征;然后采用分次真空浇筑法,制备针尖可溶且负载CRISPR/Cas9质粒、基底具有良好导电性能的双层MN贴片;采用SEM观察MN的表面形貌;采用万能试验机测试MN的压缩性能;将MN插入猪离体背部皮肤来测定其针尖溶解速率;同时,测量其针尖DNA含量及基底导电性,以及MN的体外生物相容性。（3）口腔鳞癌（OSCC）动物模型的构建及双层电转MN基因转染疗效评价:通过移植瘤法构建OSCC动物模型,分为空白对照组（Control）;阿霉素组（Dox）,注射器注射质粒+电刺激组（i.j.+E）;MN注射质粒组（p-MN）;MN注射质粒+电刺激组（p-MN+E）,待皮下肿瘤直径达3-5 mm时可以按照分组分别进行治疗。除空白对照组不治疗,阿霉素组每周给药一次外,其余组每2天治疗一次,共治疗5次。治疗完成后48 h或肿瘤长径达2 cm时处死裸鼠,取裸鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）进行体内生物相容性检测,取肿瘤组织进行H＆E染色,通过免疫组化观察PLK1和Ki67相对含量的变化,针对敲除的PLK1进行实时荧光定量PCR（q PCR）检测,同时每隔一天进行肿瘤体积及裸鼠体重的记录。结果:（1）CRISPR/Cas9表达质粒的构建和提取:成功扩增了敲除PLK1的CRISPR/Cas9质粒载体,并进行纯度和浓度测试,选取浓度大于100 ng/μL的高纯度质粒进行后续实验。（2）双层电转MN的制备及表征:首先对DA-PPy表征,SEM可见其形貌呈现纤维棒状的特殊形态,与聚吡咯（PPy）的团聚颗粒状明显不同,同时,FT-IR可见DA-PPy的红外特征光谱包含了吡咯（Py）和多巴胺（DA）的特征峰,进一步证实DA-PPy的成功合成;体式显微镜下可见制备的MN为121个（11×11）圆锥体MN阵列在平整的底板上均匀排列,SEM可见MN针尖长度约为503.33±13.33μm,每一列MN针尖之间的间距约为458.34±1.67μm。使用万用电表进行导电性测试,电流在0.7μA左右,满足电转染条件。每片MN贴片的质粒DNA载量约为24.656±9.9μg。MN的力学强度足以穿透皮肤角质层,将药物释放到皮下。插入皮肤后,MN针尖部分在5 min内溶解,最终溶解高度占MN总高度的72.82%。所制备的MN具有良好的生物相容性。（3）OSCC动物模型的构建及双层导电MN基因转染疗效评价:肿瘤体积可以直观地评价肿瘤治疗效果。与空白对照组肿瘤体积增加为初始体积的17.87倍相比,MN注射质粒+电刺激组（p-MN+E）治疗效果最好,肿瘤减小至初始体积的44.13%。同时,肿瘤组织H＆E染色、TUNEL染色、Ki67和PLK1免疫组化结果,以及q PCR结果均证实了这点。结论:本研究结果表明:使用分次真空浇筑法制备的双层导电MN与CRISPR/Cas9相结合的技术,优势在于MN可以无痛递送CRISPR/Cas9质粒至皮下肿瘤部位,而MN贴片的导电基底利于对肿瘤细胞进行电转染,提高对促进肿瘤细胞增殖的PLK1基因的敲除率。在皮下肿瘤的治疗中具有一定的应用潜力。
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