1．研究背景与研究目的：冠心病(CHD)、高血压以及糖尿病是严重影响人类健康的疾病，这些疾病最终可导致血管狭窄、心肌缺血、心肌梗死等高危心血管事件的发生，冠状动脉介入(percutaneous coronary intervention, PCI)治疗术已经成为这类疾病的重要治疗手段。然而，PCI使患者受益的同时，也会造成血管内膜的机械损伤，使内膜的结构和功能的完整性受到破坏，导致内皮细胞损伤、凋亡，巨噬细胞黏附以及平滑肌细胞迁移和过度增殖，最终造成靶血管再狭窄。因而，实现快速的再内皮化，恢复血管内皮结构和功能的完整性对抑制新生内膜增生和预防再狭窄具有重要作用。最初，有观点指出，损伤血管附近的内皮细胞迁移、增殖是实现内皮修复的主要途径。随着内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的发现，人们逐渐认识到它在内皮修复中的重要作用。研究证实，内皮祖细胞(endothelial progenitor cells, EPCs)可在血管受到损伤或者受到药物、细胞因子等刺激时候从骨髓、脾脏等部位动员到外周血，然后增殖、分化为血管内皮细胞，实现快速的再内皮化。但是，目前关于EPCs参与损伤血管内膜修复，实现再内皮化的机制仍然不完全清楚，尚需深入研究。Id1（DNA结合或分化抑制因子，Inhibitor of DNA binding/differentiation1）是一类具有螺旋-环-螺旋（helix-loop-helix, HLH）结构的分子，是刺激细胞增殖、抑制细胞分化的相关蛋白，在推进细胞周期进程、促进细胞增殖等方面具有重要的作用。近来研究提示Idl的表达和血管发生存在相关性，是新的促血管生成分子。提高Id1表达可以通过促进VEGF的转录，抑制血管生成抑制剂TSP-1的转录，以及募集EPCs等多种途径促进血管生成。并且有研究发现，Id1过表达可以促进EPCs的增殖，促进损伤血管修复。最近有研究发现，Id1在肿瘤的发生和发展过程中有重要作用，其可以通过激活核因子κB（nuclear factor kappa B, NFκB）/survivin相关信号通路，抑制细胞凋亡，促进血管新生最终促进多种肿瘤细胞的增殖。NFκB是一种多功能的核转录因子，主要存在于细胞浆中，可以通过调节IL-1、IL-2、VEGF等细胞因子以及多种的黏附分子、趋化因子、生长因子等维持细胞、机体的稳态。NFκB在炎症反应以及促进细胞增殖等方面具有重要作用。NFκB可以调节凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosisprotein, IAP)家族的新成员survivin的表达，survivin为NFκB的下游信号，可抑制细胞凋亡，促进细胞增殖，它不仅仅在肿瘤细胞、组织中有表达，而且在损伤大脑、心肌、肾脏等组织均有表达。我们前期研究证实，survivin在EPCs以及损伤血管也有表达。因此，我们提出假设，Id1可通过NFκB/survivin相关信号通路促进EPCs增殖，并在损伤血管修复中起到重要作用。为此，在本实验中，我们拟通过建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，探讨Id1及NFκB/survivin信号通路之间的关系，以及它们在损伤血管修复中的作用。2．研究方法：2.1大鼠脾源性EPCs的分离、培养和鉴定无菌条件下取出大鼠的脾脏，在200目滤网上剪碎、研磨，然后采用密度梯度离心法，获取大鼠脾源性的单个核细胞，在含20%的小牛血清的DMEM低糖培养基内贴壁培养。待生长至7天左右，于倒置显微镜下观察并记录EPCs的形态学特征；使用Dil-AC-LDL和FITC-UEA-I双染鉴定以及DAPI核定位来确定所培养细胞是否为EPCs；向获得的培养细胞内分别加入抗大鼠的FITC-CD133、PE-CD34、CD45以及VEGFR-2抗体，用流式细胞仪检测所培养细胞的表型。2.2观察Id1在EPCs内表达及定位待EPCs培养至7天左右，采用免疫荧光检测Id1在EPCs内定位，RT-PCR及Western blot方法检测Id1在EPCs内表达，并使用Western blot方法观察VEGF对EPCs内Id1表达影响，使用ELISA法检测Id1对VEGF表达影响。通过以上方法确定EPCs内Id1定位、表达情况及其影响因素。2.3观察Id1及NFκB/survivin相关信号通路对EPCs增殖影响获取培养7天左右的大鼠脾源性EPCs，通过Ad-Id1转染，si-Id1干扰，观察Id1过表达和干扰对EPCs的增殖以及对Id1、NFκB、survivin等蛋白的影响；分别使用NFκB阻断剂BAY11-7082，survivin阻断剂YM155等进行干预，观察NFκB、survivin等信号分子在Ad-Id1致EPCs增殖中的变化，进一步明确Id1/NFκB/survivin相关信号通路在EPCs增殖中的作用。2.4探讨Id1及NFκB/survivin相关信号通路在损伤血管修复中的作用使用180—220g的SD雄性大鼠，建立大鼠颈动脉球囊损伤模型，分别于血管损伤后0h、6h、12h、24h、2d、7d、14d、21d等时间点获取损伤侧颈总动脉，提取组织RNA和蛋白，使用RT-PCR方法检测Id1、NFκB、survivin等mRNA表达水平的变化，采用Western blot法检测Id1、NFκB、survivin等蛋白在损伤血管中的变化；分别使用NFκB阻断剂BAY11-7082，survivin阻断剂YM155等进行干预，观察它们对Ad-Id1转染的球囊损伤血管组织中Id1、NFκB、survivin等mRNA和蛋白表达的影响；用Ad-Id1转染球囊损伤的血管，分别于血管损伤后第7、14、和21天，采用伊文氏蓝染色和HE染色法检测Id1过表达对血管再内皮化、血管损伤后内膜反应性新生的影响；分别使用NFκB阻断剂BAY11-7082，survivin阻断剂YM155等进行干预，观察它们对Ad-Id1转染的球囊损伤血管的再内皮化、内膜反应性新生的影响。3．研究结果：3.1Id1在EPCs内表达及定位3.1.1大鼠脾源性EPCs的分离、培养以及鉴定于倒置显微镜下观察分离培养细胞的形态，培养第1天，可见单个核细胞散布在培养液中呈圆形，胞体透亮，折光性好；培养第4天，可以观察到细胞增多增大，绝大多数细胞贴壁生长，伸展呈椭圆形、短梭形，有少量细胞突起；继续培养到7天后，所有细胞均贴壁生长，长梭形、纺锤状细胞较前明显增多，可见明显的细胞聚集倾向；培养14天以后，可看到细胞首尾相连，具有网状血管样或条索状生长趋势。对培养4—7天的EPCs，用FITC-UEA-I、Dil-Ac-LDL以及DAPI进行染色鉴定。在激光共聚焦显微镜下观察，细胞摄取FITC-UEA-I后表现为绿色荧光，摄取Dil-Ac-LDL后呈现红色荧光，细胞核摄取DAPI后显示蓝色荧光，荧光双染阳性细胞合成后胞浆呈黄色荧光，胞核呈蓝色，表示正在分化的EPCs。对于培养4—7天的贴壁细胞，利用流式细胞仪，通过流式细胞分析(FACS)技术，分别检测CD34、CD45、CD133以及VEGFR-2在分离培养细胞表面的表达。结果显示，CD34、CD133以及VEGFR-2在培养细胞中的阳性率分别为76.94%、92.51%和90.81%，而造血细胞表面抗原CD45的阳性表达率比较低（5.93%），可以认为本实验室用密度梯度离心法分离、培养得到的EPCs纯度较高。3.1.2观察Id1在EPCs内表达及定位免疫荧光检测发现，静息状态下ECPs内可见Id1表达，主要位于EPCs的胞浆内，胞核内也有一定的表达。通过RT-PCR及Western blot方法检测证实，在EPCs内有Id1的表达。进一步检测发现，VEGF刺激可促进EPCs内Id1的表达，过表达Id1也可促进VEGF的转录。3.2Id1通过NFκB/survivin促进EPCs增殖3.2.1NFκB和survivin的EPCs定位提取培养7天左右EPCs的蛋白，然后进行western blot检测，结果显示，在EPCs内有NFκB和survivin蛋白的表达。并且，通过免疫荧光检测发现在静息状态下，NFκB主要定位于EPCs的细胞浆，survivin也主要定位于细胞浆内。3.2.2Ad-Id1转染对EPCs增殖的影响通过Western blot方法检测证实，Ad-Id1转染后，EPCs中Id1，p-PI3K，p-Akt，p-IκB，和survivin表达以及NFκB的核转位明显上调，高于对照组（p<0.05）。采用MTS法分析在Ad-Id1影响下，EPCs增殖能力变化。结果发现，与对照组比较，Ad-Id1可明显促进EPCs增殖（p<0.05）。3.2.3Id1基因沉默对EPCs增殖的影响通过Western blot方法检测证实，Id1基因沉默后，与对照组相比EPCs中Id1，p-PI3K，p-Akt，p-IκB，和survivin蛋白表达下调，NFκB的核转位明显降低（p<0.05）。采用MTS法分析在si-Id1影响下，EPCs增殖能力变化。结果发现，与对照组比较，si-Id1可明显抑制EPCs增殖（p<0.05）。3.2.4NFκB和survivin阻断对Ad-Id1转染所致EPCs增殖的影响通过Western blot方法检测证实，使用PI3K阻断剂LY294002和Akt阻断剂Aktinhibitor可明显降低EPCs内p-Akt，p-IκB，和survivin蛋白表达，以及NFκB的核转位；NFκB阻断剂BAY11-7082可显著降低p-IκB、survivin蛋白表达以及NFκB的核转位而不影响p-PI3K和p-Akt的表达；使用survivin阻断剂Curcumin以及YM155可明显降低survivin蛋白表达，而不影响p-PI3K，p-Akt，p-IκB，NFκB蛋白表达（p<0.05）。采用MTS法分析EPCs增殖能力变化。结果发现，与对照组比较，NFκB/survivin信号通路相关分子阻断剂可明显抑制EPCs增殖（p<0.05）。3.2.5PI3K/Akt通路阻断对Id1表达的影响通过Western blot方法检测证实，在没有外源性Id1作用时，PI3K阻断剂LY294002可下调Id1和p-Akt的表达；然而，在Ad-Id1转染的EPCs内，PI3K阻断剂LY294002仅下调p-Akt的表达，而对表达Id1没有影响。3.3NFκB/survivin在Id1促损伤血管内膜修复中作用3.3.1血管损伤修复过程中Id1、NFκB和survivin的表达变化RT-PCR结果显示，血管损伤6h后，Id1mRNA表达开始上调，至24h达到高峰，然后逐渐下降至正常水平；NFκB mRNA于损伤6h后开始上调，12h达到高峰，然后逐渐下降；survivin mRNA于损伤6h后开始上调，2d时候达到高峰，然后逐渐下降；Western blot结果显示，血管损伤12h后，Id1蛋白表达开始上调，至14d达到高峰，然后逐渐下降至正常水平；NFκB蛋白于损伤24h后开始上调，7d达到高峰，然后逐渐下降；survivin蛋白于损伤24h后开始上调，14d时候达到高峰，然后逐渐下降。3.3.2BAY11-7082、YM155等对损伤血管NFκB和survivin表达影响RT-PCR结果显示，BAY11-7082干预后，损伤血管内的NFκB以及survivin mRNA表达下调，而Id1mRNA表达不变；经survivin阻断剂YM155干预后，损伤血管内survivin mRNA表达下调，而对Id1，NFκB mRNA的表达没有影响；Western blot结果显示，BAY11-7082干预后，损伤血管内的NFκB以及survivin蛋白表达下调，而Id1蛋白表达不变；经survivin阻断剂YM155干预后，损伤血管内survivin蛋白表达下调，而对Id1，NFκB蛋白的表达没有影响。3.3.3Id1过表达可促进损伤血管实现快速再内皮化结果显示，损伤7d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组再内皮化率分别是28.35±3.74%、41.76±5.52%，差异显著（P<0.05）；损伤14d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组再内皮化率分别是39.57±4.03%、62.31±5.19%，差异显著（P<0.05）；损伤21d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组再内皮化率分别是71.68±5.24%、75.8±4.33%，无显著差异（P>0.05）。说明Id1过表达可促进损伤血管实现快速再内皮化。3.3.4过表达Id1可抑制血管内膜早期反应性增生结果显示，损伤7d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组内膜、中膜比值（I/M）分别是0.157±0.031、0.126±0.027，无显著差异（P>0.05）；损伤14d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组内膜、中膜比值（I/M）分别是0.693±0.032、0.299±0.035，差异显著（P<0.05）；损伤21d时，Ad-GFP组、Ad-Id1组内膜、中膜比值（I/M）分别是1.365±0.068、1.294±0.052，无显著差异（P>0.05）。以上结果提示，Id1过表达可促抑制血管内膜早期反应性增生。3.3.5BAY11-7082、YM155等可减弱Id1过表达的促损伤血管快速再内皮化作用结果显示，损伤14d时，Ad-Id1组、Ad-Id1+BAY11-7082以及Ad-Id1+YM155组再内皮化率分别是68.35±5.76%、47.9±4.17%、49.7±4.85%，差异显著（P<0.05）（图5A）。以上结果说明，NFκB/survivin信号阻断可减弱Ad-Id1促损伤血管快速再内皮化的作用。3.3.6NFκB/survivin信号阻断可减弱Ad-Id1的血管内膜早期反应性增生抑制作用结果显示，损伤14d时，Ad-Id1组、Ad-Id1+BAY11-7082以及Ad-Id1+YM155组内膜、中膜比值（I/M）分别是0.337±0.016、0.725±0.054、0.683±0.041，差异显著（P<0.05）。以上结果提示，阻断NFκB、survivin相关信号因子可减弱Ad-Id1的血管内膜早期反应性增生抑制作用。4．研究结论：4.1Id1、NFκB、survivin在静息状态EPCs和损伤的大鼠颈动脉均有表达；4.2过表达Id1可通过NFκB/survivin信号通路促进体外培养EPCs增殖、以及促进损伤血管再内皮化；4.3过表达Id1可通过NFκB/survivin信号通路抑制损伤血管内膜早期反应性增生；4.4沉默Id1基因可抑制体外培养EPCs增殖，并下调NFκB/survivin信号通路分子表达；4.5阻断NFκB/survivin信号通路可减弱Ad-Id1促损伤血管再内皮化作用，以及Ad-Id1的血管内膜早期反应性增生抑制作用。