以重组NP为抗原GPMV抗体间接ELISA检测方法的建立

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1997年以来,在我国许多地区爆发了由鹅副粘病毒(Goose Paramyxovirus,GPMV)引起的鹅的烈性传染病。该病是以消化道和呼吸道病变为主要特征,具有高度发病率和死亡率,给养鹅业带来了很大的损失。国内外学者先后建立了琼脂扩散试验、中和试验、血凝抑制试验等血清学诊断方法,在一定程度上为防治鹅副粘病毒病发挥了重要作用,但同时也存在灵敏度差、操作烦琐、检测所需时间长等不足,已不适应更有效地控制该病的需要。 本论文将鹅副粘病毒NP基因的重组质粒pGEX-6P-NP转化到工程菌BL21(DE3)pLysS内,重组NP蛋白在大肠杆菌中获得了表达,并且进行了切胶纯化。用表达的融合蛋白作为包被抗原,以灭活油苗免疫制得的鹅血清做为一抗,HRP标记的兔抗鹅血清作为二抗,并确定了ELISA最佳工作条件,即抗原包被浓度为54μg/ml,4℃包被过夜,血清(1:800)和酶标兔抗鹅(1:1500)分别在37℃1h,底物溶液37℃显色20min。对各项条件和参数进行了优化,为开发标准化诊断试剂盒奠定了坚实的基础。通过对检测抗原的交叉试验及阻断试验均证明,检测抗原只与抗GPMV抗体发生特异性结合。健康非免疫鹅血清及SPF鸡血清的检测均出现阴性结果。鸡胚尿囊液中的GPMV可阻断检测抗原与相应阳性血清的结合,证明该检测抗原的特异性是可靠的。所建立的方法重复性好、特异性强、灵敏度高。可用于GPMV流行病学的调查和GPMV灭活苗免疫后血清抗体水平的检测。
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