论文部分内容阅读
目的:建立以荷EL9611红白血病细胞的BALB/c(H-2d)小鼠为受鼠,BALB/C×C57BL/6杂交F1代CB6F1(H-2d/b)小鼠为供鼠的四大模型:MHC半相合异基因骨髓移植后复发模型、常规供体淋巴细胞输注(t DLI)模型、细胞因子干扰素-α(IFN-α)活化的供体淋巴细胞输注(a DLI)模型,地西他滨联合a DLI(DAC+a DLI)模型,比较不同DLI组GVL效应和GVHD差异,并进行相关免疫作用机制的探究方法:建立荷EL9611(H-2d)红白血病细胞的BALB/c H-2d小鼠接受BALB/C×C57BL/6杂交F1代小鼠CB6F1H-2d/b来源的MHC半相合异基因骨髓移植(BMT)模型。移植前制备供鼠骨髓细胞(BMCs)和脾细胞(SCs),BALB/c小鼠提前7天接种1×106个EL9611白血病细胞,在X射线直线加速器8Gy全身照射(TBI)后行(供鼠)CB6F1H-2d/b→(受鼠)BALB/c H-2d方向骨髓移植,实验分为两部分:第一部分:异基因骨髓移植后复发模型及DLI组脾细胞输注数目探讨。分为:A组(异基因骨髓移植后复发模型):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个,不给予任何治疗;B组(t DLI组):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个+不同剂量SCs:1×107(B1组),1.5×107(B2组),2×107(B3组);C组(a DLI组):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个+不同剂量SCs:1×107(C1组),1.5×107(C2组),2×107(C3组),3天后开始予重组IFN-α20000U/d皮下注射,出现严重GVHD时停药。比较各组小鼠生存期及GVHD表现,得出最佳脾细胞输注数目。第二部分:DLI治疗组。分为:D组(t DLI组):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个+SCs 1.5×107;E组(a DLI组):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个+SCs 1.5×107,3天后开始予重组IFN-α20000U/d皮下注射,出现严重GVHD时停药;F组(DAC+a DLI组):TBI后输注供鼠来源的BMCs5×106个,SC1.5×107个,3天后开始予地西他滨(达珂)1mg/kg/只皮下注射×3天,重组IFN-α20000U/d皮下注射,GVHD反应严重时停药。每组小鼠10只,每组实验重复三次。观察各组小鼠生存时间、白血病负荷、GVHD表现、组织病理学改变等;并通过流式细胞术比较D组、E组和F组小鼠移植后外周血活化的CD8+T淋巴细胞,外周血和肝脏、脾脏、肺CD4+CD25+Treg细胞的表达;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)比较D组、E组和F组小鼠移植后外周血血浆中相关细胞因子IFN-γ、TNF-a、TGF-β、IL-10、IL-35表达水平差异。结果:第一部分实验组小鼠的平均生存时间(移植后)分别为A组(9.8±2.3)d;B1组(19.0±5.12)d、B2组(23.4±4.03)d、B3组(26.4±4.53)d;C1组(22.5±4.19)d、C2组(32.9±3.78)d、C3组(20.6±4.59)d。A组、B1、C1组小鼠在移植后全部死亡,组织病理学检查示复发死亡;C3组小鼠于移植后早期大量死亡,出现严重GVHD表现,考虑由于脾细胞输注数目过大,GVHD反应严重导致死亡增加。综合考虑不同脾细胞输注数量组生存时间长短及下一步实验操作可控性,选择脾细胞数目SCs为1.5×107/只。第二部分实验组小鼠平均生存时间分别为:D组(21.7±7.76)d、E组(34.9±8.04)d、F组(45.6±8.48)d,E组较D组生存时间延长,差异有统计学意义(P<0.05),F组较D组、E组生存时间延长,差异有统计学意义(P<0.05)。其中D组小鼠全部死亡,E组和F组分别有11/30和20/30小鼠长期存活,其余死亡。D组及F组小鼠出现轻度的弓背、耸毛、体重下降等GVHD表现,a GVHD临床评分分别为1.88±0.64、1.74±0.72,E组较D组及F组GVHD加重,临床评分为3.32±0.91(P<0.05)。移植后+10d,+17d,+24d取D组、E组和F组小鼠肝脏、肠道、皮肤病理学检查结果显示,E组小鼠淋巴细胞浸润程度较D组及F组加重,其中移植后+17d左右淋巴细胞浸润程度最严重。流式结果显示:在移植后同一时段,E组及F组小鼠外周血活化CD8+T细胞百分比较D组升高,即a DLI组和DAC+a DLI组较t DLI组肿瘤杀伤细胞CTL细胞数目多,抗白血病效应强;其中F组小鼠各时间段外周血及GVHD靶器官免疫负调控Treg细胞比例较D组及E组升高。ELISA结果显示,在移植后同一时段小鼠外周血中细胞因子IFN-γ,TNF-a,E组细胞因子水平最高,与t DLI组相比有统计学意义(P<0.05),免疫负调控细胞因子TGF-β、IL-10,F组较D组和E组升高并且有统计学意义(P<0.05),其中IL-35 F组较D组及E组升高但是无统计学意义(P>0.05)。结论:本实验成功构建了荷EL9611(H-2d)急性红白血病细胞株的BALB/c H-2d小鼠(受鼠)接受CB6F1H-2d/b小鼠(供鼠)来源的MHC半相合异基因骨髓移植后复发模型,并在此基础上给予不同的过继免疫治疗方案,成功建立了常规供体淋巴细胞输注(t DLI)模型、细胞因子IFN-α活化的供体淋巴细胞输注(a DLI)模型、地西他滨联合a DLI模型(DAC+a DLI);初步研究表明IFN-α可能通过增强CD8+CTL的活化、杀伤效应,以及细胞因子的分泌来提高a DLI的GVL和GVHD效应,地西他滨可能通过增加免疫负调控Treg细胞及细胞因子TGF-β、IL-10免疫抑制作用降低靶器官发生GVHD的严重程度,而其GVL效应相关细胞及细胞因子与a DLI组并无差异,进而在不影响抗白血病效应同时降低严重GVHD发生而延长移植后复发小鼠的生存时间。