两个抗褐飞虱相关基因的功能分析

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小表达蛋白基因(small Expressed Protein,s EP)是指ORF长度为450bp以内的表达蛋白(Expressed Protein,EP)的基因。EP在水稻基因组中广泛存在,因有EST和FL-c DNA数据证明其具有转录及翻译活性而被命名。s EP是小开放阅读框(small Open Reading Frame,s ORF)的一种,曾因难以注释和鉴定而被忽略。近年来,随着测序等技术的进步,具有转录及翻译活性的s ORF被大量发现,并证实其具有影响植物的生长发育等功能。而s EP在水稻对褐飞虱(Nilaparvata lugens St(?)l,BPH)取食的响应过程中是否发挥作用未被阐明,因此我们希望在鉴定出新的水稻抗褐飞虱相关基因,与此同时也希望可以探索s EP是否具有抗虫功能及研究价值。前期研究中,本实验通过转录组技术获得大量受BPH诱导表达的s EP,本文中我们选取了其中2个持续上调且上调倍数高的s EP进行研究,并将它们命名为水稻抗褐飞虱相关蛋白(BPH Resistance related Protein)。其中将LOC_Os12g05690命名为OsBRP1(BPH Resistance related Protein 1),将LOC_Os02g50110命名为OsBRP2(BPH Resistance related Protein 2)。荧光定量PCR结果验证了OsBRP1和OsBRP2在抗感材料中均被褐飞虱诱导上调。随后,我们通过转基因技术获得了OsBRP1和OsBRP2对应的敲除和过表达株系,以此作为对象进行基因的抗虫功能鉴定。与野生型(WT)相比,OsBRP1的过表达株系抗性下降,OsBRP2的敲除株系抗性升高,而OsBRP1的敲除株系和OsBRP2的过表达株系的BPH抗性与WT无显著差异,因此OsBRP1和OsBRP2对水稻BPH的抗性有影响。此外,OsBRP1过表达株系还呈现植株矮化、叶夹角增大、育性下降的性状,OsBRP2也曾被鉴定出影响水稻花柱长度。因此,OsBRP1和OsBRP2不仅影响水稻对褐飞虱的抗性,还能影响植株生长发育。随后我们通过亚细胞定位、启动子顺式作用元件分析、组织表达分析、互作蛋白预测、测定激素相关基因表达量来进行OsBRP1和OsBRP2的作用机理进行探索。明确了:OsBRP1在细胞核和细胞膜上共定位,而OsBRP2仅定位于细胞核;OsBRP1和OsBRP2的启动子均具有大量组织特异性元件、压力响应元件、激素响应元件和转录因子作用位点;OsBRP2在植株体内的表达量高于OsBRP1,2个基因在水稻根茎叶中均呈现相对较高的表达量,但OsBRP1在花药和柱头中无表达,OsBRP2在柱头和花药中表达量高。OsBRP1和OsBRP2具有大量的激素响应元件,尤其是JA、Me JA响应元件;并且预测出与激素相关的基因互作,尤其是OsBRP2预测出于较多的JAZ蛋白互作;在JA相关基因的表达量检测中OsBRP1和OsBRP2的转基因株系皆表现出了与WT有显著差异,因此我们推测OsBRP1和OsBRP2的可能会影响植株体内的JA的信号。综上所述,OsBRP1和OsBRP2是受到褐飞虱取食诱导的基因,影响水稻的褐飞虱抗性和生长发育。它们的功能验证也说明了部分s EP在水稻抗虫和生长发育中具有重要作用,更多s EP的功能值得挖掘与鉴定。
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