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目的谷氨酸诱导的神经元兴奋性毒性损伤是脓毒症相关性脑病(sepsis-associated encephalopathy,SAE)形成和发展的机制之一。本研究的主要目的是探讨microRNA-219(miR-219)对谷氨酸诱导的大鼠海马神经元兴奋性毒性损伤的保护作用,并通过其靶基因初步探索其作用机制,旨在为将来探索SAE复杂发病机制提供新的思路和基础实验数据。第一部分microRNA-219对谷氨酸损伤大鼠海马神经元保护作用方法(1)获取原代大鼠(孕18-19天)海马神经元,进行细胞培养,利用NF-200细胞免疫荧光进行鉴定。(2)建立谷氨酸诱导的大鼠海马神经元细胞毒性损伤细胞模型,依不同谷氨酸浓度、不同作用时间分组。(3)谷氨酸损伤后,利用MTT检测大鼠海马神经元细胞活力的变化。(4)谷氨酸损伤后,利用qRT-PCR检测大鼠海马神经元中miR-219表达的变化。(5)转染miR-219 mimic至大鼠海马神经元中,利用qRT-PCR检测海马神经元中miR-219是否出现过表达,利用MTT检测过表达miR-219对谷氨酸诱导损伤的海马神经元细胞活力的影响。(6)利用流式细胞仪(FCM)检测过表达miR-219对谷氨酸诱导损伤的大鼠海马神经元细胞凋亡的影响。结果(1)大鼠原代海马神经元成功培养后,鉴定结果显示:海马神经元纯度达90%以上,符合后续实验的要求。(2)谷氨酸诱导损伤后,MTT检测结果显示:所有实验组的海马神经元细胞活力均有下降,与正常组差异具有统计学意义(p<0.05)。并且,海马神经元细胞活力的下降程度与谷氨酸浓度和作用时间呈现依赖关系。根据实验结果,在后续实验中,谷氨酸诱导损伤模型的制备选择谷氨酸浓度125μM和作用时间15min。(3)谷氨酸诱导损伤后,qRT-PCR检测结果显示:所有实验组的海马神经元中miR-219的表达下降,与正常组差异具有统计学意义(p<0.05),并且,海马神经元中miR-219表达的下降程度与谷氨酸浓度呈现依赖关系。(4)转染miR-219 mimic至海马神经元,qRT-PCR检测结果显示:与正常对照组和阴性对照组(mimic control)相比,miR-219 mimic转染组海马神经元中miR-219的表达增高,差异均具有统计学意义(p<0.01)。(5)转染miR-219 mimic至海马神经元,谷氨酸诱导损伤后,MTT检测结果显示:miR-219 mimic转染组海马神经元的细胞活力较阴性对照组增高,差异具有统计学意义(p<0.05)。(6)转染miR-219 mimic至海马神经元,谷氨酸诱导损伤后,FCM检测结果显示:与正常对照组相比,谷氨酸诱导损伤组海马神经元的细胞凋亡比例较正常对照组增加,差异具有统计学意义(p<0.01)。而miR-219 mimic转染组海马神经元细胞凋亡比例较阴性对照组有改善,差异具有统计学意义(p<0.01)。结论(1)成功对原代大鼠海马神经元进行细胞培养并建立谷氨酸诱导海马神经元损伤模型。(2)谷氨酸诱导损伤后,海马神经元中miR-219的表达明显下降。(3)在海马神经元中转染miR-219 mimic,可以增加miR-219的表达,而过表达miR-219改善了谷氨酸诱导损伤所致的海马神经元细胞活力的下降和细胞凋亡的增加,说明miR-219具有一定的神经兴奋性毒性保护作用。第二部分microRNA-219对神经元兴奋性毒性保护作用机制初步研究方法(1)利用http://www.targetscan.org/寻找miR-219可能调控的靶基因,并选择合适的靶基因。(2)构建CAMKⅡγ荧光素酶重组表达载体和突变体,通过荧光素酶报告基因检测系统,验证CAMKⅡγ是miR-219调控靶基因。(3)利用Western blot检测海马神经元中过表达miR-219对CAMKⅡγ蛋白表达的影响。(4)利用qRT-PCR检测谷氨酸诱导损伤后,海马神经元中CAMKⅡγmRNA表达的变化。(5)利用ELISA检测谷氨酸诱导损伤后,海马神经元中过表达miR-219对Caspase-3活性的影响。(6)利用Western blot检测谷氨酸诱导损伤后,海马神经元中过表达miR-219对凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)表达的影响。(7)利用分子克隆技术构建CAMKⅡγ重组表达载体pcDNA3.1-CAMKⅡγ,并将重组表达载体转染入大鼠海马神经元中,Western blot检测海马神经元中CAMKⅡγ蛋白的表达。(8)通过挽救实验再次验证miR-219通过调控靶基因CAMKⅡγ的表达,来发挥对谷氨酸诱导损伤海马神经元保护作用。(9)利用Western blot检测过表达miR-219发挥谷氨酸损伤后保护作用的细胞信号通路。结果(1)Targetscan预测结果显示共有212个可能靶基因受miR-219的调控,筛选我们感兴趣的靶基因为CAMKⅡγ。(2)荧光素酶报告基因检测系统分析结果显示:与阴性对照组(mimic control)相比,CaMKⅡγ野生型(wild type,WT)与miR-219 mimic共转染组荧光素酶的活性降低,差异具有统计学意义(p<0.01),而其他组没有变化。(3)CAMKⅡγ蛋白表达Western blot结果显示:与正常对照组和阴性对照组(mimic control)相比,miR-219 mimic转染组CAMKⅡγ蛋白的表达下降,差异具有统计学意义(p<0.01)。(4)在谷氨酸诱导损伤后,qRT-PCR检测结果显示:与正常对照组相比,谷氨酸低剂量组海马神经元中CAMKⅡγmRNA的表达升高,差异具有统计学意义(p<0.05)。而谷氨酸中剂量组(125 μM)和高剂量组(250 μM)海马神经元中CAMKⅡγ mRNA的表达升高更显著(p<0.01)。CAMKⅡγ mRNA的表达升高与谷氨酸浓度呈现依赖关系。(5)Caspase-3活性ELISA分析结果显示:与正常对照组相比,125μM谷氨酸损伤后海马神经元中Caspase-3活性升高,差异具有统计学意义(p<0.01)。miR-219 mimic转染组海马神经元中Caspase-3活性低于阴性对照组(mimic control),差异具有统计学意义(p<0.01)。(6)凋亡相关蛋白(Bax和Bcl-2)表达Western blot分析结果显示:与正常对照组相比,125 谷氨酸损伤海马神经元后,神经元中Bcl-2/Bax 比值降低,差异具有统计学意义(p<0.01)。与阴性对照组(mimic control)相比,miR-219 mimic转染组Bcl-2/Bax比值则升高了,差异具有统计学意义p<0.05)。(7)挽救实验Western blot分析结果显示:与正常对照组和空载体转染对照组(vector control)相比,CAMKⅡγ重组表达载体转染组(pcDNA3.1-CAMKⅡγ)海马神经元中CAMKⅡγ蛋白的表达增高,差异具有统计学意义(p<0.01)。与pcDNA3.1-CAMKⅡγ 转染组相比,pcDNA3.1-CAMKⅡγ miR-219 mimic 共转染组中CAMKⅡγ蛋白的表达降低,差异有统计学意义(p<0.01)。(8)挽救实验MTT分析检测结果显示:所有谷氨酸诱导组的海马神经元细胞活力均明显下降,差异具有统计学意义(p<0.01)。然而,在谷氨酸处理后,与重组表达载体转染组(pcDNA3.1-CaMKⅡγ+glutamate)相比,空载体转染组(pcDNA3.1+glutamate)和共转染组(pcDNA3.1-CaMKⅡγ +miR-219 mimic+glutamate)的细胞活力的下降程度小,差异具有统计学意义(p<0.05)。(9)Western blot检测结果显示:与正常对照组(normal control)相比,谷氨酸损伤后,海马神经元中p-Akt/t-Akt的比值明显上升(p<0.05)。而在谷氨酸作用后,加入通路抑制后,p-Akt的表达则显著下降(p<0.01)。谷氨酸损伤后,与阴性对照组(mimic control)相比,miR-219 mimic转染组的p-Akt的表达则升高显著,差异具有统计学意义(p<0.01),t-Akt的表达变化不明显,差异没有统计学意义(p>0.05)。结论(1)CAMKⅡγ是miR-219调控靶基因,海马神经元中miR-219可以抑制CAMKⅡγ蛋白的表达。(2)谷氨酸诱导损伤后,海马神经元中CAMKⅡγ mRNA的表达明显上升;miR-219通过调控靶基因CAMKⅡγ的表达来发挥保护作用。(3)谷氨酸诱导损伤后,miR-219能够抑制Caspase-3酶的活力和提高Bcl-2/Bax比值来减轻谷氨酸诱导损伤海马神经元的细胞凋亡。(4)miR-219通过PI3K/Akt细胞信号通路来发挥对谷氨酸诱导损伤海马神经元的保护作用。