丁酮威,O-(N-甲基氨甲酰)-3-甲巯基丁酮肟,属于一类氨基甲酸酯类杀虫剂农药。毒理机制是通过抑制一些重要蛋白如乙酰胆碱酯酶的生物活性达到防治害虫的目的,对人类和动物具有高毒性(大鼠的LD50值为153mg/kg)。吡虫啉,1-(6-氯吡啶-3-吡啶基甲基)-N-硝基亚咪唑烷-2-基胺,是农业生产中被广泛使用的杀虫剂,是一种系统、触杀和酰氯性的烟碱类农药。吡虫啉作为突触后的烟碱乙酰胆碱受体的兴奋剂,可以改变昆虫的行为,并导致死亡,作为杀虫剂被广泛用于控制对虫、蓟马、小菜蛾和白粉虱。由于丁酮威和吡虫啉的不合理使用,在农产品和环境样品中可能会残留丁酮威和吡虫啉农药,残留的化学农药会严重危害到环境的安全和人类的健康,因此,亟需建立快速、灵敏和经济的检测丁酮威和吡虫啉农药的检测方法,相比于传统的仪器分析方法,免疫分析技术在操作、价格、现场和高通量筛选等方面具有一定的优势,所以将会在农药残留快速检测技术中发挥越来越重要的作用。而目前还没有关于丁酮威免疫分析方法和吡虫啉单残留免疫层析试纸条的报道。一.利用合成的四种丁酮威半抗原制备出抗丁酮威单克隆抗体氨基甲酸酯类农药,如丁酮威,被公认为有害的物质,因为它们对非靶标生物的毒性以及在环境和农产品中的持久性。因此,为了农产品的安全亟需发展一种快速和灵敏的检测丁酮威的方法。本文中,利用丁酮威的肟酯结构,设计合成了四种丁酮威半抗原(H1,H2,H3和H4),与载体蛋白BSA偶联成H3-BSA和H4-BSA作为免疫原,与载体蛋白OVA偶联成H1-、H2-、H3-和H4-OVA作为包被原。对BALB/c小鼠进行腹腔注射免疫。通过PEG1500将小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合制备杂交瘤细胞。通过对融合的杂交瘤细胞株进行筛选和亚克隆,成功获得了分泌抗丁酮威单克隆抗体的细胞株(1C9)。抗体的亚型为IgG1型,轻链为kappa链,可以用于下一步分析作为建立检测氨基甲酸酯类农药丁酮威免疫分析的材料。二.建立了检测丁酮威残留的化学发光酶免疫分析方法利用制备的抗丁酮威单克隆抗体1C9建立了能够用于检测氨基甲酸酯类农药丁酮威的化学发光酶免疫分析方法。为了使建立的间接竞争化学发光酶免疫分析(ic-CLEIA)具有更好的灵敏性,从4种包被抗原中筛选出灵敏性最好的包被抗原H2-OVA,优化的包被原稀释梯度为8000倍,抗体稀释梯度为8000倍,盐离子强度为1.6 mol/L,pH值8.0。在优化的工作环境下,CLEIA分析方法的线性范围为27-2700 ng/ml,最低检测限为20ng/ml,抗体最高的交叉反应率为1.95%,来自丁酮氧威。对苹果、青菜和水的添加回收率从97.18%到107.00%。此外,将CLEIA的检测结果与HPLC的检测结果进行了比较验证,两种分析方法的检测结果接近。建立的免疫分析方法能为开发试剂盒提供基础支持,同时也为建立一个简单有效的(如免疫层析试纸条分析)以筛选目的和评估环境中的丁酮威残留提供了依据。三.通过两种免疫分析方法证实了灵敏的方法需要更少的包被原和抗体本文中,我们利用一种新的丁酮威半抗原合成免疫原免疫BALB/c雌性小鼠,筛选得到一株高亲和性和选择性的抗丁酮威单克隆抗体。基于生物素化的抗体,建立了间接竞争酶联免疫分析方法(bi-ELISA)和间接竞争电化学免疫分析方法(bi-ECIA)检测农产品中的丁酮威残留。在优化的实验条件下,合成了生物素化的抗体,同时,bi-ECIA法中包被原的用量是bi-ELISA法的1/2(0.031 and 0.062μg/mL),bi-ECIA法中生物素化抗体的用量是bi-ELISA法的1/4(0.07 and 0.28μg/mL)。依据各自的分析模式,bi-ECIA和bi-ELISA的最低检测限(LOD)分别是1.41和7.55 ng/mL,结果表明bi-ECIA比bi-ELISA的灵敏度高五倍。同时,对苹果和青菜添加丁酮威标准品,bi-ECIA和bi-ELISA添加回收率分别为89.6%到108.5%和87.2%到109.8%。四.基于信号放大和半定量分析技术建立了检测吡虫啉的免疫层析试纸条方法建立了一种新的基于裸眼的一步信号放大半定量免疫层析试纸条(SAS-ICA)检测农药吡虫啉,该方法依据竞争免疫反应。信号放大作用是通过试纸条检测线上双标的高亲和性金标生物素化抗吡虫啉单克隆抗体(nanogold-BAb)和金标链霉亲和素(nanogold-Sa)实现。NC膜上三条相对颜色强度的检测线用于SAS-ICA试纸条直接可视的分析,分析物浓度可以通过观察三条检测线在放大区域的消失情况进行半定量。在优化的实验条件下,通过视觉检查SAS-ICA试纸条可以检测到吡虫啉的浓度范围:0-5 ng/mL(阴性样品),5-25 ng/mL,25-250 ng/mL,250-1000 ng/mL和>1000 ng/mL(阳性样品)。SAS-ICA试纸条的灵敏度(TL-Ⅲ的可视检测线)和半定量分析能力(TL-Ⅲ完全消线)分别比传统试纸条的高10倍和160倍。在实验室和田间环境条件下,用建立的SAS-ICA试纸条方法分析了添加的和真实污染的白菜样品,并且与HPLC的结果进行了验证。对所有基于ICA的检测方法而言,该方法可以作为一个具有广阔应用前景的技术。五.总结综上所述,本文利用合成的四种丁酮威半抗原首次报道了抗丁酮威单克隆抗体,利用化学发光酶免疫分析方法检测农产品和环境中的丁酮威残留。并建立了检测丁酮威的酶联免疫分析法和电化学免疫分析法,通过比较验证,证明了灵敏的分析方法相对需要更少的包被原和抗体。同时,基于生物素-链霉亲和素系统,放大免疫层析试纸条分析的检测信号,并利用三条不同颜色强度的检测线,达到半定量检测,从而实现了基于裸眼的一步信号放大半定量免疫层析试纸条检测吡虫啉。