全球变暖带来的负面影响不断增加,利用可再生木质纤维素生产生物燃料受到了世界各国科学家们的广泛关注。异丁醇是最接近汽油的生物燃料之一,利用发酵法合成异丁醇具有广阔的市场前景和研究意义。酿酒酵母可利用自身基因合成少量异丁醇,可以作为异丁醇生物合成的优势宿主菌。因此,在酿酒酵母中以纤维素为碳源合成异丁醇具有重要的战略意义。但酿酒酵母自身不能利用纤维素。纤维素经纤维素酶（C1-CX）水解后得到纤维二糖,构建可利用纤维二糖的酿酒酵母菌株并优化纤维二糖利用途径,有助于提高酵母对纤维素的利用率。本工作将在酿酒酵母中构建纤维二糖利用途径,并进行优化以提高纤维二糖利用率,以尝试用于异丁醇的生物合成。首先,本工作在酿酒酵母W303-1A中表达了两种纤维二糖转运蛋白（来自于大肠杆菌的Lac Y和来自于粗糙脉孢菌的CDT-1）和两种β-葡萄糖苷酶（来自于Saccharophagus degradans的bgl3C和来自于粗糙脉孢菌的GH1-1）,构建了六株可利用纤维二糖的工程菌,并测定了六株工程菌的纤维二糖利用能力。结果表明Lac Y和CDT-1这两个转运蛋白的纤维二糖转运能力无显著差异。通过与载体p RS316-PGK1p-gh1-1-CYC1t表达的β-葡萄糖苷酶组合,工程菌W303-1A GL和W303-1A GC生长良好且纤维二糖利用能力显著高于其他菌株,胞内β-葡萄糖苷酶的酶活最高可达到0.51U/mg。从而确定了最佳纤维二糖利用途径的表达基因组合。其次,对酿酒酵母异丁醇合成途径进行优化。通过CRISPR/Cas9基因编辑技术将强启动子PGK1p插入ILV2和ILV5的开放阅读框前,完成了无标记基因引入的基因过表达,构建得到菌株W303-1A C235和EMS39 C235。之后在菌株W303-1A C235和EMS39 C235中使用单拷贝质粒进一步过表达ZWF1和SPT15基因,提高了菌株生长和碳源利用能力,从而确定异丁醇合成途径优化方案。将最佳纤维二糖利用途径与优化的异丁醇合成途径进行耦合,构建得到四株可利用纤维二糖合成异丁醇的工程菌。纤维二糖发酵结果表明,在表达Lac Y的菌株中同时过表达ZWF1和SPT15基因不利于菌株在纤维二糖上的生长,而在表达CDT-1的菌株中同时过表达ZWF1和SPT15基因可以促进菌株在纤维二糖上的生长。工程菌HZALC-1和HZALC-21在含有10 g/L纤维二糖培养基中生长良好,初始OD600=0.5的条件下发酵60 h达到最大细胞密度,分别为OD600=8.54和8.74,β-葡萄糖苷酶酶活分别于14 h（0.66 U/mg）与28 h（0.51U/mg）达到最高酶活。本工作成功构建出两株能较好利用纤维二糖的酿酒酵母工程菌,为后续利用纤维素合成异丁醇奠定了实验基础。此外,本工作研究了异丁醇高耐受工程菌EMS39 235O高产异丁醇的分子机制。通过基于RNA-seq的转录组分析筛选出401个差异表达基因。初步分析表明,相比于对照菌W303-1A 235O,工程菌EMS39 235O在应对环境压力（醇应激、热应激、氧化应激、酸应激等）、葡萄糖吸收、中央碳代谢、线粒体功能（氧化磷酸化、线粒体翻译等）等方面显著优于对照菌。进一步分析发现,上述途径的变化可能由五个转录因子（Met28p、Met32p、Hap4p、Cat8p和Znf1p）上调导致。研究结果揭示了工程菌EMS39 235O高产异丁醇的分子机制,为研究酿酒酵母的异丁醇耐受性机制提供了新的思路。