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狂犬病是由狂犬病病毒(Rabies virus,RABV)感染宿主而引起的一种传染性疾病,病死率高达100%。根据世界卫生组织(WTO)报道,全球每年约有59000人死于狂犬病,其中大部分来自于亚洲和非洲地区的发展中国家,而在亚洲地区狂犬病的高发区主要集中在印度和中国。虽然狂犬病疫苗的应用可以预防狂犬病病毒的传播,但狂犬病的治疗仍然面临诸多问题,目前常用的各种抗病毒疗法均未能成功治疗狂犬病。最近出现的CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)-Cas9系统可以对任何物种基因组进行基因定点编辑,且较先前的基因编辑技术更为简单、快捷和高效,为诸多难以根治的病毒性感染、遗传病以及染色体缺陷等疾病的治疗带来了曙光。G蛋白是狂犬病病毒唯一的囊膜蛋白,是控制狂犬病病毒复制不可或缺的蛋白。G蛋白负责病毒吸附细胞入侵过程,因此作为狂犬病病毒的主要毒力蛋白。本研究利用CRISPR-Cas9定点剪切G蛋白,使其发生基因缺失,从而抑制病毒复制。本研究我们设计了4组对针对糖蛋白(G)的gRNA,构建作用于狂犬病毒糖蛋白的CRISPR-Cas9载体,用流式细胞术筛选出对病毒复制抑制效率较高的gRNA。之后用筛选出来的gRNA作用于SAD株、DRV株、CVS株和B2c株等不同毒株的狂犬病病毒,通过测序检测靶序列发现G蛋白发生序列部分缺失以及多处突变。最后模拟体内多次给药环境,我们将CRISPR-Cas9系统连续作用于狂犬病毒两次,发现CRISPR-Cas9可以显著抑制狂犬病病毒在胞内的复制。结果CRISPR-Cas9质粒PX459-gRNA构建成功,并筛选出PX459-G223作为最优gRNA;验证了构建的系统对狂犬病毒复制抑制的有效性,并且多次转染可以达到更好的效果。研究结果表明在RABV感染的细胞中CRISPR-Cas9系统能够破坏狂犬病病毒G蛋白基因组,从而在细胞水平上抑制狂犬病病毒的复制,这表明CRISPR-Cas9系统介导的G蛋白基因编辑为狂犬病基因治疗提供了可能性。