背景与目的α-地中海贫血(简称“地贫”)是世界上最常见的单基因遗传病之一,分布于包括非洲、地中海地区、中东、印度次大陆、东南亚和中国南方在内的全球热带和亚热带疟疾高发地区,这些地区α-地贫携带者频率高达10%-15%。α-地贫属常染色体隐性遗传病,其分子基础是位于16号染色体末端16p13.3位点上的人α-珠蛋白基因(HBA1和HBA2)的先天性遗传缺陷。遗传缺陷的后果是α-珠蛋白肽链合成减少或缺如,从而血红蛋白生成障碍,并导致无效造血和红细胞破坏而产生溶血性贫血。α0-地贫是指2个顺式排列的α-基因丢失的突变,主要分布于东南亚地区(包括中国南方地区),如(SEA)、(—THAI)、(FIL)等。α-地贫的纯合子为严重致死、致残性溶血性贫血,导致Hb Bart’s水肿综合征。当父母双方均为α0-地贫携带者,则生育的孩子有25%的概率为Hb Bart’s胎儿水肿征患者。目前临床上一般采用绒毛吸取或羊膜腔穿刺的取材技术,应用现代遗传分析技术通过产前诊断对受累患儿进行有效地检测,但这些有创伤性的传统的取材方法可引起0.5%1%的流产风险。在妊娠过程中,母体血浆中存在胎儿有核红细胞和游离胎儿DNA,这一发现为基于母体血浆游离胎儿DNA的无创伤性产前诊断开辟了新的领域,同时为监测胎儿的遗传状况提供了新的取材途径。目前利用母体血浆进行无创伤性产前诊断可鉴定胎儿性别、RhD血型,随着一批高灵敏度的分子诊断技术的发展,还可通过母体血浆游离的胎儿DNA来检测胎儿是否继承父源性的致病突变,这已成功地应用于一些单基因遗传病的无创伤性产前诊断,如强直性肌营养不良症、软骨发育不全、囊性纤维化、先天性肾上腺增生症(CAH)、亨延顿舞蹈症和β-地中海贫血等。当胎儿双亲携带不同的致病突变时这些检测方法尤其有用。近年研究发现另一种检测途径,即当父母双方携带相同致病突变时,通过母体血浆游离胎儿DNA检测胎儿是否继承与父源性致病突变连锁的SNP多态性位点的等位基因来进行无创伤性产前诊断。当父母双方携带相同大片段缺失突变时,由于缺乏特异性的遗传标记,通过母体血浆游离胎儿DNA准确地对胎儿进行基因分型,技术上还存在很大的挑战。另一方面,由于游离的胎儿DNA片段的特性(99%的胎儿DNA片段长度<313 bp),利用基于普通PCR的技术很难有效地检测胎儿的大片段缺失突变。最近Ho等利用(SEA/)缺失断裂点内2个微卫星多态性位点,通过检测母体血浆游离胎儿DNA来判断胎儿是否遗传父源性的非缺失染色体上的STR等位基因,从而进行Hb Bart’s胎儿水肿综合征的无创伤性产前诊断。但是在(SEA/)缺失区域内的STR位点数目和多态性信息非常有限,因此该技术最多只能应用于诊断1/3的高危家庭。此外,目前国内外很少研究者利用孕妇血浆中的胎儿DNA来涉足重型α-地贫的无创伤性产前诊断,研究该病无创伤性诊断的技术和应用论文数量也很有限。因此,本研究拟以α-地中海贫血作为研究对象,在基于复合PCR扩增的微测序技术筛查(—SEA/)基因缺失断裂点内胎儿双亲有信息性的SNP位点的基础上,结合等位基因特异性实时荧光PCR技术来检测低拷贝的单核苷酸差异,探索检测母体血浆胎儿父源性的正常染色体上的SNP等位基因的新方法,为HbBart’s胎儿水肿综合征的无创伤性产前诊断提供新的诊断策略,并且收集67个α0-地贫高风险家庭进行临床应用评价,本研究诊断策略的建立将能填补我国在重要遗传病无创产前诊断领域的空白,为我国的优生优育工作作出贡献。同时通过群体筛查获得一组有诊断价值又代表中国南方人群种族特征的候选SNP数据库。材料与方法样品采集从本教研室样品库中分别挑选了α-珠蛋白基因型为aα/aa和基因型为—sEA/αα的无关个体基因组DNA样品各150例,用于筛查α-珠蛋白基因簇(—SEA/)缺失断裂点内的SNP位点。从上述群体样品中选择40例已测序样本作为标准品,用于建立能同时检测多个SNP位点的基于复合PCR扩增的微测序技术。此外,从2008年6月至2010年6月,从67例需要进行绒毛吸取或羊膜腔穿刺检查的孕妇采集10 ml外周血(术前抽取),同时抽取其配偶外周血。67例孕妇的孕周在8.5-25周之间,平均孕周为19.12±3.61周；孕妇年龄在20-41岁之间,平均年龄为27.16±4.89岁。67个高风险家庭的胎儿双亲α-地贫的基因型均为(SEA/)缺失突变,其中一个家庭除外(胎儿父亲的基因型为—THAI/αα)。本研究已经过当地伦理委员会的同意,并得到所有受检者的理解并签署相关的书面知情同意书,样品处理和母体血浆DNA提取孕妇外周血在1600 g离心10分钟后分别收集血沉棕黄层和血浆,用标准的酚-氯仿抽提法提取血层棕黄层的基因组DNA；第一次离心收集得到的血浆在16000 g再离心10分钟。抽取2 ml离心后的血浆,按照Qiagen公司生产的QIAamp DNA blood Mini Kit的操作流程(稍作改良)提取每例孕妇的血浆DNA。羊水样品经过处理后提取胎儿DNA,利用基于多重PCR的微测序技术进行SNP位点的基因分型和利用Gap-PCR技术检测α-地贫缺失突变。诊断策略当胎儿双亲携带相同大片段缺失突变时,通过筛查缺失断裂点内双亲有信息性的SNP位点,利用母体血浆游离胎儿DNA检测非缺失染色体上的等位基因是否存在。只有在母体血浆游离胎儿DNA中排除遗传自父亲非缺失染色体上的等位基因时,针对高风险胎儿的无创伤性产前诊断才有确诊价值(排除重症缺失型遗传病的可能性),如果在母体血浆游离胎儿DNA中父源性的等位基因检测结果为阳性,则被检胎儿个体有二种可能性：重症缺失型遗传病或缺失基因携带者。本研究主要内容分为3个部分：(1)采集67对α-地中海贫血高风险夫妇的外周血,其中外周血内血沉棕黄层用于胎儿双亲基因组DNA的提取：孕妇外周血的血浆用于提取母体血浆DNA(包括母源性DNA和游离胎儿DNA),并利用GAPDH和SRY基因通过实时荧光定量PCR技术建立相应的标准曲线分别对母体血浆总DNA和游离胎儿DNA的浓度进行定量分析。(2)建立可同时筛查多个SNP位点的基于复合PCR扩增的微测序技术,并应用其来寻找胎儿双亲(SEA/)缺失基因断裂点内有信息性的SNP位点。(3)选择胎儿双亲一个或以上有信息性的SNP位点,根据母体血浆DNA浓度的定量分析结果,建立以母体血浆游离胎儿DNA为模板的高特异性和高灵敏度的等位基因特异性实时荧光PCR基因分型技术,对67个高风险家庭的胎儿进行无创伤性产前检测,其结果将与四个合作单位传统产前诊断的结果进行双盲对照分析。缺失断裂点内有信息性的SNP位点的筛查67对高风险地贫夫妇的基因组DNA用于筛查有信息性的SNP位点,这为利用等位基因特异性实时荧光PCR技术进行无创伤性产前排除诊断提供检测靶点。使用Perkin Elmer Gene Amp PCR system 9600热循环仪对9个SNP位点进行复合PCR扩增,通过加入荧光染料标记的ddNTP在ABI 3730遗传分析仪上进行等位基因特异性引物延伸的微测序技术进行SNP位点的基因分型,然后用专为观测峰的颜色和片段长度范围设计的GeneMapper v3.7软件进行等位基因自动化分析。母体循环中血浆DNA的定量分析利用GAPDH看家基因和SRY基因的特异性引物和探针,通过实时荧光定量PCR技术对67个孕妇循环母体血浆总DNA和游离胎儿DNA的浓度进行定量分析。按照Birch课题组报道的方法进行操作,以健康非妊娠女性基因组DNA作为标准品,倍比稀释成5个不同浓度的模板来制作标准曲线。结合标准曲线和每个血浆DNA样本对应的CT值,可以计算其对应的起始模板浓度。等位基因特异性PCR技术的灵敏性和特异性分析利用携带有9个SNP位点各自不同等位基因的—SEA/αα杂合子样本,以携带其中一个等位基因的样本定义为父源性DNA,携带另一个等位基因的样本定义为母源性DNA,对携带母源性DNA稀释成不同的浓度,按照1：1、1：2、1：5、1：10、1：20、1：50、1：100、1：500、1：1000、1：5000和1：10000的比例与父源性的基因组DNA进行混合,制备成人工模拟的母体血浆DNA模板。每个SNP位点以人工模拟的母体血浆DNA模板进行等位基因特异性实时荧光PCR检测,分析其特异性和敏感性。每轮实验重复两次。同时根据缓冲液的组成、温度、PCR扩增循环数和不同的引物对来进行相应的优化。最后,利用ΔCT(Patemal-Maternal)方法来计算父源性等位基因和母源性等位基因之间的量的差异。母体血浆父源性遗传的胎儿SNP等位基因的检测针对67个高风险地贫家系,根据前面通过基于复合PCR扩增的微测序技术检测得到的9个SNP位点的基因分型结果,每个家系将选择一个或更多个胎儿双亲存在差异的有信息性的SNP位点,利用上述优化成功的AS-PCR技术,通过美国Strategene Mx 3005荧光PCR仪操作平台以孕妇母体血浆低拷贝的游离胎儿DNA为模板检测父源性正常染色体上的等位基因是否存在,从而对我们建立的整个诊断策略进行临床应用评价。结果在中国南方人群450条染色体上共筛查得到16个SNP位点,其中9个最小等位基因频率(minor allele frequency, MAF)>0.15的位点作为本研究的候选SNP位点。67个孕妇的血浆DNA的平均浓度为611.63±284.50基因组当量/ml,其中31个怀有男胎的孕妇的血浆DNA平均浓度为47.35±30.49基因组当量/ml,为了使AS-PCR技术检测能有效进行,母体血浆DNA模板的浓度范围需在50-1556基因组当量/ml。本研究97%样本的外周血在4个合作单位分离血浆后通过快递服务公司运输,但21和38号样本由于合作单位在收集和处理血样时发生溶血,释放的母源性DNA大大增多,使孕妇血浆DNA的浓度增高(分别为49940和53300基因组当量/m1)。为了避免这两个样本对统计分析结果的干扰,我们在数据分析过程中就剔除这两个样本。利用已测序的40个无关个体样品(其中基因型为αα/αα和——SEA/αα的个体各20例)作为标准品,建立了一种可靠、高通量的可同时检测多个SNP位点的基于复合PCR扩增的微测序技术,40例无关个体9个SNP位点基因分型的结果测序结果完全一致(灵敏性为100%)。利用已建立的微测序技术,对收集到的67对高风险地贫夫妇的基因组DNA进行9个SNP位点的基因分型。结果发现,65对夫妇9个SNP位点的分型结果显示存在一个或以上有信息性的SNP位点,检出率达到97%,有2对夫妇9个SNP位点基因分型结果完全一样,因此无法进行区分。为了建立高灵敏性和高特异性的AS-PCR技术,构建了一系列入工模拟的样本。模拟实验结果表明,我们建立的AS-PCR技术可以检测低至2个拷贝的父源性的等位基因。我们以人工模拟的母体血浆DNA为模板进行实时荧光AS-PCR扩增,为了确定AS-PCR区分母源性DNA和父源性DNA的能力,在此引入ΔCT值的方法进行分析。综合9个SNP位点ACT值的数据和熔解曲线分析结果,AS-PCR在父源性等位基因占母源性等位基因的2%(1：50)时仍可以有效扩增,但低于2%时父源性等位基因无法扩增出来。根据每个SNP位点扩增曲线得到的数据和信息,我们这部分数据和信息后划分了△CT(Paternal-Maternal)的临界值,如果ΔCT值>6为母源性等位基因(父源性等位基因不存在),如果ACT值<6则父源性等位基因存在。根据以人工模拟的母体血浆DNA为模板建立的AS-PCR的反应体系和反应条件,选择一个或两个胎儿双亲有信息性的SNP位点,我们对65个高风险地贫孕妇的母体血浆DNA进行AS-PCR检测,最后利用△CT(Patemal-Maternal)方法进行了分析。我们发现在33个孕妇的母体血浆DNA中检测到父源性非缺失染色体上的等位基因,30个孕妇只检测到母源性等位基因。65个孕妇微测序技术和AS-PCR(?)支术检测结果显示,共有5个高风险地贫家庭只存在1个有信息性的SNP位点,检测的灵敏性为100%,特异性为100%；存在2个有信息性的SNP位点的高风险家庭共有6个,检测的灵敏性为100%,特异性为100%；存在3个有信息性的SNP位点的高风险家庭共有7个,检测的灵敏性为100%,特异性为100%；存在4个有信息性的SNP位点的高风险家庭共有5个,检测的灵敏性为100%,特异性为100%；存在5个有信息性的SNP位点的高风险家庭共有25个,检测的灵敏性为100%,特异性为81.8%,2例血浆样品由于运输过程形成溶血而导致不确定结果；存在6个有信息性的SNP位点的高风险家庭共有15个,检测的灵敏性为100%,特异性为100%；存在7个差异的有信息性的SNP位点的家系共有2个,检测的灵敏性为100%,特异性为100%。65个高风险地贫家系检测的灵敏度为100%,特异性为93.8%。63个孕妇母体血浆的无创伤性诊断结果与传统的产前诊断方法检测的结果完全吻合。在67例血浆样本中,我们准确地对33例样本进行了—SEA纯合子的无创伤性产前排除检测,诊断率为49.3%(95% CI 25.4%-78.6%)。分析和讨论通过群体SNP位点筛查我们鉴定了一组位于(SEA)缺失断裂点内的候选SNP位点。由于这些候选SNP位点也在其他两种缺失突变(—THAI和—FIL)的缺失断裂点内,因此本研究的诊断策略可扩展到这两种缺失型突变的无创伤性产前排除诊断。利用基于复合PCR扩增的微测序技术可检测出97%的高风险夫妇存在一个或更多个有信息性的SNP位点,其中两个家系9个SNP位点的基因型完全相同,不存在有信息性的SNP位点,无法识别父源性等位基因和母源性等位基因。如果更多的样品用于鉴别有信息性的SNP位点,我们可通过检测父源遗传的胎儿正常等位基因存在与否来排除约50%的高风险个体,能克服微卫星位点只能排除1/3高风险孕妇的限制。以往研究表明通过检测胎儿父源性遗传的致病突变或检测与父源性遗传的胎儿突变等位基因连锁的SNP位点,可进行一些单基因遗传病(如p-地贫、软骨发育不全、强直性肌营养不良等)的无创伤性产前诊断。然而,目前通过可靠的方法利用母体血浆游离胎儿DNA对缺失型单基因遗传病进行无创伤性产前诊断的应用非常少,本研究的诊断策略成功地应用于α-地贫的无创伤性产前检测,其还可扩展到其他因基因缺失引起的常染色遗传病的检测,如22q11.2缺失综合征和缺失型β-地贫。孕妇母体血浆游离胎儿DNA的提取是一个重要因素,除此之外,基于复合PCR的微测序技术和等位基因特异性实时荧光PCR技术是本研究诊断策略的关键要素。通过基于复合PCR扩增的微测序技术可对高风险地贫夫妇同时检测缺失断裂点内9个SNP位点,本研究结果表明超过90%的高风险夫妇存在1-7个有信息性的SNP位点。因此,在临床实践应用过程中,只要胎儿双亲存在一个或以上有信息性的SNP位点,就可以在母体血浆中通过检测父源遗传的胎儿等位基因进行无创性产前排除诊断。在胎儿双亲差异SNP位点中挑选一个有信息性的SNP位点,通过等位基因特异性实时荧光PCR技术可以直接进行排除诊断。在必要的情况下,可再选择另一个差异的SNP位点对同一血浆样本重复检测以验证前一次的结果的准确性。本研究从67例血浆样本中准确地对33例样品进行了—SEA纯合子的无创产前排除检测(诊断率为49.3%),其结果与用传统的产前诊断方法检测的结果相一致。2例血浆样品由于运输过程形成溶血,导致母体血浆中母源DNA浓度增高,对检验结果造成很大的干扰,从而导致假阴性结果。结论本研究建立了基于复合PCR扩增的微测序技术与等位基因特异性实时PCR技术相结合的诊断策略,通过母体血浆DNA分析能直接应用于α-地贫纯合子的无创伤性产前排除诊断。对于缺失型单基因遗传病,在缺失断裂点内检测父源性正常染色体上的等位基因,能用于排除50%受累患儿,使50%孕妇避免传统创伤性产前诊断的检查。这种降低相关疾病风险的诊断策略能广泛地应用于具有地域性的常见缺失型单基因遗传病的诊断。