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禽流感（Avian influenza, AI）全名是鸟禽类流行性感冒，是由禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）引起的禽类重要传染病之一，自从1878年首次在意大利报道以来，给世界养殖业造成了巨大的损失。同时高致病禽流感（HPAI）除了感染鸟禽外，已经跨越物种障碍感染猪、犬、甚至人类。自从1997年在香港发现人类也会感染禽流感之后，此病才引起全世界卫生组织的高度关注。其后，本病一直在亚洲地区零星爆发，但从2003年12月开始，禽流感已在世界各地均有爆发，并造成多人死亡。所以，寻求一种能够迅速生产、廉价、高效的新型流感疫苗对于禽流感的防控具有重要的意义。本研究以H5N1亚型禽流感病毒A/Chicken/ZF/1/2011（H5N1）的cDNA为模板，利用带有特定酶切位点的引物PCR扩增HA基因，一方面将HA基因直接连到pShuttle-CMV腺病毒穿梭质粒中，形成重组穿梭质粒pShuttle-CMV-HA；另一方面将HA基因亚克隆到质粒pCAGGS中，再次将含HA基因及CAG启动子的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pShttle中，构建了重组穿梭质粒pShuttle-CAG-HA。利用Pme I限制性内切酶线性化重组穿梭质粒，然后电转化含有腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的BJ5183感受态细胞，获得重组腺病毒质粒Ad-CMV-HA和Ad-CAG-HA。将两种腺病毒重组质粒Pac I酶切后，按照脂质体转染方法转染AD293细胞，基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变效应（CPE），筛选到两株重组腺病毒rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA。经RT-PCR、间接免疫荧光试验（IFA）和Western-blot试验表明，目的基因已重组到腺病毒的基因组中，并且表达的蛋白具有良好的生物性活性。两株重组腺病毒经过增殖后，其TCID50分别为2.38×108/ml、2.56×108/ml。将获得的重组腺病毒rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA通过肌肉注射的方式免疫6周龄的BALB/c小鼠（6只/组）及SPF鸡（10只/组），初免3周后进行加强免疫。在小鼠试验中，初免2周后，rAd-CMV-HA组和rAd-CAG-HA组均检测到HI抗体，其几何平均数为1:10和1:28；初免3周后，HI效价为1:57和1:80，加免2周后效价迅速上升至1:254和1:254。以A/Chicken/Ahui/2009（H5N1）AIV攻毒，两免疫组体重略有下降即恢复，并无死亡情况，而对照体重下降明显，且分别有两只小鼠死亡。SPF鸡试验中，初免2周后，rAd-CMV-HA组和rAd-CAG-HA组均检测到HI抗体，其几何平均数为1:8和1:10；初免3周后，效价为1:18和1:24，加免2周后效价迅速上升至1:60和1:74。以A/Goose/QFY/2004（H5N1）AIV毒株进行攻毒，显示rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA对SPF鸡的保护率在70%和80%，而对照组SPF鸡在两天内全部死亡。以上结果表明rAd-CMV-HA和rAd-CAG-HA重组腺病毒可以对BALB/c小鼠及SPF鸡对H5N1AIV的攻击提供高效保护。本研究获得了两株能分别利用CMV和CAG启动子控制表达AIV HA基因的复制缺陷型重组腺病毒，动物试验结果证明它们对BALB/c小鼠及SPF鸡具有良好的免疫保护性，从而为AIV基因工程活载体疫苗的研制奠定了基础。