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1目的在国医大师洪广祥教授治肺不远温的学术思想指导下,探讨IPF的中医病因病机,总结温法在IPF治疗中的具体运用,并由此归纳温法治疗IPF的循证医学证据;通过实验研究,建立H2O2诱导的小鼠肺间充质干细胞的氧化损伤模型,检测温肺化纤汤预处理后相关通路上的蛋白分子,揭示温肺化纤汤抗氧化的分子机制。2方法2.1理论探讨搜集关于IPF的相关中医经典文献,阐释中医历代名家对IPF的认识;结合国医大师治肺不远温的学术思想,阐释温法在IPF治疗中的具体运用和温肺化纤汤的临床疗效;搜集现代关于温法治疗IPF的临床研究资料,进行温法治疗IPF的系统性评价。2.2实验研究2.2.1细胞建模取三只健康C57BL/6小鼠,脱颈处死后获取小鼠肺间充质干细胞。通过流式细胞术对第10代小鼠肺间充质干细胞进行表型鉴定和细胞周期检测;并进行成脂、成骨及成软骨诱导分化。使用H2O2（100,200,400,600,800,1000μM）作用于小鼠肺间充质干细胞6小时,用MTT检测细胞活力。2.2.2细胞分组及给药将小鼠肺间充质干细胞以8×104/ml种植于96孔板或六孔板,细胞贴壁生长24小时后,将细胞孔分为对照组,模型组,温肺化纤汤低、中、高剂量预处理组进行给药:（1）对照组:加入培养液24小时后,吸弃培养液,加入新鲜培养液继续培养6小时;（2）模型组:加入培养液24小时后,吸弃培养液,加入含有H2O2（800μM）的培养液处理6小时;（3）温肺化纤汤低、中、高剂量组:加入含有温肺化纤汤（100、200、400μg/ml）的培养液24小时后,吸弃培养液,加入含有H2O2（800μM）的培养液处理6小时。2.2.3检测指标2.2.3.1显微镜下观察细胞形态及成脂油红染色、成骨茜素红染色和成软骨阿尔新蓝染色;流式细胞术检测细胞表面抗原Sca-1、CD54、CD45、CD44、CD11b和细胞周期。2.2.3.2通过MTT法检测细胞活力;使用相关试剂盒检测各组细胞的LDH、SOD和MDA水平。2.2.3.3使用Hoechst凋亡染色和流式细胞学检测细胞凋亡;Western blot检测各组细胞凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2及Cleaved caspase-3的表达;RT-PCR检测各组细胞Bax、Bcl-2和Cytochrome C的mRNA表达。2.2.3.4使用流式细胞术检测各组细胞的ROS及线粒体膜电位;Western blot检测各组细胞抗氧化通路蛋白分子Akt、p-Akt、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1的表达;RT-PCR检测各组细胞Nrf-2和HO-1的mRNA表达。3结果3.1理论探讨IPF的中医病因病机与脏腑亏虚,痰瘀互结,壅塞肺络密切相关,其中气阳虚弱、寒凝痰瘀、外感寒湿占据着重要地位,这也是IPF使用温法治疗的基础。温肺化纤汤是温法治疗IPF的经验方,该方集温阳、散寒、化瘀于一体,是治肺不远温学术思想的智慧结晶。通过对温法治疗IPF的临床研究系统性分析发现,与单纯西药治疗相比,温法治疗IPF能有效提高总有效率、明显改善咳嗽、喘息等中医主要症候,改善肺功能,提高生活质量,同时避免长期口服激素带来的毒副作用。合理辨证使用温法治疗IPF是值得探讨和推广的治疗策略。3.2实验研究3.2.1小鼠肺间充质干细胞（mLMSCs）的分离提取、纯化鉴定及诱导分化结果小鼠肺间充质干细胞在镜下观察呈现纺锤状、梭状,类似于纤维细胞。细胞生长曲线呈现典型S形,即静止期、倍增期和平台期;成脂诱导分化后,细胞镜下呈现红色。成骨诱导分化后,钙化结节与染料结合而镜下呈现橘红色。成软骨诱导分化后,软骨细胞与阿尔新蓝结合镜下呈现蓝色。细胞周期显示大部分细胞处于静止期,少部分细胞处于分裂增殖期;流式细胞术检测表明细胞的表型为Sca-1+/CD54+/CD44+/CD45-/CD11b-。3.2.2温肺化纤汤对H2O2氧化损伤mLMSCs保护作用初步评价不同浓度的温肺化纤汤（50、100、200、400、800μg/ml）处理小鼠肺间充质干细胞24小时,与对照组相比,除800μg/ml组外（P<0.05）,其余各组的细胞存活率无明显差异（P>0.05）。不同浓度的过氧化氢（200、400、600、800、1000μM）处理小鼠肺间充质干细胞6小时,与对照组相比,除200μM组外（P>0.05）,其余各组的细胞存活率呈剂量依赖性下降。（P<0.05,P<0.01）。不同浓度的温肺化纤汤（100、200、400μg/ml）处理小鼠肺间充质干细胞24小时,再用H202（800μM）处理6小时,结果表明,与对照组相比,模型组细胞存活率显著降低（P<0.01）。与模型组相比,温肺化纤汤低、中、高剂量组均可以提高细胞存活率（P<0.01）;与正常对照组相比,模型组的LDH、MDA显著升高,SOD显著降低（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组LDH、MDA显著下降,SOD显著上升（P<0.01）。3.2.3温肺化纤汤对H2O2诱导mLMSCs细胞凋亡的影响Hoechst凋亡染色结果表明,对照组中的mLMSCs细胞核呈蓝色,分布均匀,基本未见凋亡坏死的固缩细胞核。模型组中的mLMSCs可见颜色发白的固缩细胞核,甚至可见致密浓染的碎块状细胞核。温肺化纤汤的预处理组明显减少凋亡细胞,并与温肺化纤汤的浓度呈现正相关性;流式细胞学检测细胞凋亡率表明,与正常对照组相比,模型组细胞凋亡率显著升高（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的细胞凋亡率则显著下降（P<0.01）。与正常对照组相比,模型组Bcl-2/Bax比值显著降低（P<0.01）,Cleaved caspase-3显著提高（P<0.01）,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显著升高,Bcl-2mRNA相对表达量明显降低（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01）,Cleaved caspase-3显著降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA相对表达量显著升高,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显著降低（P<0.05,P<0.01）;与低剂量组相比,温肺化纤汤的中、高剂量组的Bcl-2/Bax比值显著升高（P<0.01）,Cleaved caspase-3显著降低（P<0.01）,Bcl-2mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）,BaxmRNA、Cytochrome CmRNA相对表达量显著降低（P<0.01）。3.2.4温肺化纤汤抗氧化作用机制探讨与正常对照组相比,模型组ROS生成量显著升高（P<0.01）,线粒体膜电位明显下降（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组ROS生成量则显著下降（P<0.01）,线粒体膜电位明显升高（P<0.01）;与低浓度组相比,温肺化纤汤中、高浓度组ROS生成量明显减少（P<0.01）,线粒体膜电位明显升高（P<0.01）。JC-1染色后各组在荧光显微镜下观察,对照组红色荧光和绿色荧光视野合并后基本呈现红色荧光,可见散在少许绿色荧光。模型组视野合并后可见大量绿色荧光。通过温肺化纤汤低、中、高浓度预处理后,各处理组视野合并后的绿色荧光逐渐减少,红色荧光逐渐增多。与正常对照组相比,模型组p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达无明显差异（P>0.05）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）;与模型组比较,温肺化纤汤低、中、高浓度组的p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达量显著升高（P<0.01）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）;与低剂量相比,温肺化纤汤的中、高剂量组的p-Akt/t-Akt比值、c-Nrf2、n-Nrf2及HO-1表达显著升高（P<0.01）,Nrf-2mRNA、HO-1mRNA相对表达量显著升高（P<0.01）。4结论基于温法创制的温肺化纤汤可以显著提高细胞活力,减少LDH、MDA生成、增强SOD活性,抑制ROS产生,修复细胞线粒体膜电位,逆转细胞凋亡,从而改善小鼠肺间充质干细胞由H2O2诱导的氧化损伤。其机制可能与激活Akt蛋白磷化,促进Nrf-2核转位,上调HO-1蛋白表达从而正向调控Akt/Nrf-2/HO-1信号通路有关。