非酒精性脂肪肝（Non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD）是全球公认的最为常见的以发病缓慢、机体代谢改变为特征的肝脏疾病之一。NAFLD包括从肝脏脂肪变性在内的多种良性可逆性病理改变,也可进展为更加严重而且不可逆性的病理改变,如24%的患者可以发展为非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis,NASH）和肝硬化（cirrosis）;<15%的患者可能最终从肝硬化发展为肝衰竭和肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma,HCC）。NASH的进展阶段,可进展为纤维化、甚至肝细胞癌,严重威胁生命。关于NAFLD进展为NASH的发病机制普遍共识为“多次打击（multiple hitting）”学说,脂质堆积造成氧化应激、脂质过氧化、炎症等是最关键因素之一。大量脂肪在肝细胞中积聚过多而发生NAFLD,引发一系列细胞毒性反应,最终导致炎症及纤维化。然而,在临床上,NASH的发生发展是复杂多样的,“多次打击”理论不能完全解释该病的发生和发展,甚至最新的研究表明纤维化是保护肝脏的一种代偿方式。此外,多种层次和不同来源的氧化应激等其他因素对NASH发生和发展的影响还有待进一步研究。低氧是最为常见的病理状态,而且多项证据证实慢性缺氧与NASH的发病机制密切相关。临床上最常见的全身性慢性缺氧是阻塞性睡眠呼吸暂停（OSAS）综合征,可以导致肝脏损伤,并可诱发心脏代谢综合征和NAFLD。加之,当前人们摄入高脂饮食和久坐等生活习惯,导致慢性间歇性低氧联合高脂饮食可导致脂质堆积、炎症和脂质过氧化时常发生并相伴。此外,多种因素都在表明,NAFLD的肝损伤和纤维化的进展似乎与缺氧有关。多项研究证实,长期居住在高海拔人群的肌肉、肝脏等组织线粒体氧化水平显著性高于居住在低海拔地区的人。而且这种现象与海拔升高和肝脏损伤明显相关。作为血供较为丰富的人体重要器官之一,肝脏对低氧刺激极其敏感。低氧不仅可致其微循环障碍,造成肝细胞损伤、充血、水肿及脂肪变性,严重者可引发线粒体等重要细胞器发生缺氧性损伤,最终导致细胞凋亡。长期暴露低氧环境是造成高原地区脂肪肝患病率较高的重要因素之一,可能的主要原因是低氧阻遏了部分三羧酸循环氧化反应,减少了脂肪酸β氧化的同时,增加或减少合成,进而可能引起肝脏脂质堆积,诱发脂肪肝形成。加之,脂质在肝脏大量堆积不能有效的产生分解代谢,均可引起脂质氧化应激反应,我们认为慢性低氧和高脂饮食、线粒体氧化应激等因素进而可能加重肝脏炎症和纤维化,使其发展为NASH,甚至是肝细胞癌。缺氧诱导因子（Hypoxia-inducible factor,HIFs）是生物体内细胞、组织等对缺氧刺激的反应的最关键调节因子。到目前为止,关于急慢性缺氧和HIFs在NAFLD中的作用的研究不多,但经过课题组的形态学证据表明,肝脏缺氧与NAFLD介导的脂肪变性同时发生,特别是在静脉周围,与乙醇诱导的脂肪肝较为相似。HIFs是细胞感受低氧和产生低氧效应的主要调节因子,HIF是由α和β亚基异二聚体组成,其中α可以根据结构和功能不同可分为1α和2α两种分子类型。其中缺氧诱导因子-2α（HIF-2α）是许多细胞中低氧下广泛表达的蛋白分子,其功能虽然没有HIF-1α表达广泛且意义重大,但是在肝脏、小肠和肾脏等组织中高表达,而且与脂代谢、纤维化和炎症通路的关键基因具有调节作用。前期的研究证实,HIF-2α的过度表达在高海拔地区居民肝脏等组织中普遍存在,可能是肝组织损伤的另一个潜在原因。细胞和动物实验均证实,抑制HIF-2α的表达可以减轻由细胞凋亡引起的肝组织损伤。但是,HIF-2α在脂肪肝和NAFLD进展机制的有关人类资料尚缺乏,而且HIF-2α在NASH发展过程中调节纤维化发展、促进肝细胞代谢的潜在机制仍尚不清楚。为了探讨高海拔慢性低氧暴露可能是增加NASH发病率的重要分子机制,本研究通过建立慢性缺氧的NASH小鼠模型,动态观察慢性缺氧对NASH小鼠的代谢表型（包括体重,肝指数,血糖,血清脂代谢及肝损伤指标）、病理组织学改变的影响。检测并分析了HIFs在人NASH肝脏及慢性缺氧的NASH小鼠肝脏中的表达水平,探讨其与脂质代谢、炎症和纤维化的关系,进一步说明高海拔慢性低氧是如何影响NASH疾病的分子机制。希望通过本实验的研究为NASH的发病机制提供了一些新的思路并提供一些新的干预策略。第一部分慢性低氧对小鼠NASH总体代谢表征的改变目的:探讨高海拔慢性低氧对小鼠NASH总体代谢表征的改变。方法:（1）通过以高脂、高果糖饮食水联合CCL4构建NASH（C57BL6J小鼠）模型;以普通饮食、水为ND对照组。实验总体分组:常氧NASH组（n=20）、慢性低氧NASH组（n=20）、常氧普食ND组（n=20）和慢性低氧普食ND组（n=20）。慢性低氧组小鼠饲养于海拔4300m处。常氧组小鼠饲养在海拔36m处。为动态观察各项指标变化,分别于第4周和第8周取材。（2）通过检测血常规确定模拟慢性低氧环境。（3）动态监测各组小鼠体重、肝指数、血糖、血清脂代谢（TG、T-CHO）、肝脏TG和T-CHO及肝损伤（ALT、AST）指标。（4）行H&E染色、油红O染色、天狼星红染色评估小鼠肝脏病理变化。结果:（1）与常氧ND组相比,慢性低氧ND组体重减轻,但肝指数、血糖、血清脂代谢及肝损伤指标无差异,肝脏病理学两组均无明显脂肪变性、炎症及纤维化改变。（2）与ND组相比,NASH组小鼠体重、肝重、血糖、血清脂代谢及肝损伤指标显著上升,肝脏病理学提示NASH组小鼠肝脏表现明显脂肪变性。（3）与常氧NASH组相比,慢性低氧NASH组小鼠体重、血糖减轻,但肝指数显著上升,血清TG、T-CHO以及肝脏T-CHO无差异,但ALT、AST以及肝脏TG显著上升,病理学提示慢性低氧NASH组小鼠肝脏脂肪变性、炎细胞浸润和纤维化程度也显著上升,并且,上述改变随低氧时间的延长而增加。结论:慢性低氧模拟NASH小鼠模型造模成功。慢性低氧改善NASH小鼠体重和胰岛素抵抗;慢性低氧可能不影响NASH小鼠肝脏的脂肪变性和血清TG、T-CHO的水平;慢性低氧加重了NASH小鼠血清ALT、AST的水平;慢性低氧加重了NASH小鼠肝指数和肝脏TG的沉积,而非T-CHO;慢性低氧促进NASH小鼠肝脏的炎性细胞浸润和纤维化程度。第二部分慢性低氧促进小鼠NASH进展的分子机制目的:探讨慢性低氧在NASH发展过程中的潜在机制。方法:（1）通过高脂、高果糖饮食诱导联合CCL4构建NASH（C57BL6J小鼠）模型;以普通饮食水为ND对照组。实验总体分组:常氧NASH组（n=20）、慢性低氧NASH组（n=20）、常氧普食ND组（n=20）和慢性低氧普食ND组（n=20）。为构建高海拔慢性低氧环境,慢性低氧组小鼠饲养于海拔4300m处。常氧组小鼠饲养在海拔36m处。（2）四组小鼠分别于第4周和第8周造模结束后取材（肝脏组织）,检测脂代谢相关基因（PPARα、CPT1、MTP、Apo B、FAT、FAS、ACC1、SCD、SREBP-1c）、NF-κB、炎症因子（TNF-α和IL-1β）和纤维化基因（Collagen I、α-SMA、TGF-β）的表达水平（Western Blot法或RT-qPCR法）。结果:（1）在慢性低氧的作用下,NASH组小鼠的脂肪从头合成途径相关基因（FAS、ACC1、SCD、SREBP-1c）的表达随缺氧时间的延长显著上调。（2）p-NF-κB表达上调显著,并低氧暴露呈时序性。（3）慢性低氧NASH组小鼠的炎症相关基因和纤维化相关基因的表达水平随缺氧时间的延长显著上调。结论:慢性低氧主要通过上调SREBP-1c介导的DNL相关基因（FAS、ACC1、SCD）的表达促进肝脏TG的沉积;慢性低氧可以上调NASH小鼠肝脏的炎症相关基因TNF-α和IL-1β以及p-NF-κB的表达水平以促进炎症进展;慢性低氧激活NF-κB通路进而促进NASH小鼠肝脏的纤维化相关基因Collagen I、α-SMA和TGF-β的表达水平上调,从而加重纤维化进展;DNL相关基因、p-NF-κB及纤维化相关基因的表达的上调与低氧暴露的相互作用是时序性的。第三部分HIF-2α在NASH中的调控机制目的:探讨HIF-2α在NASH发展过程中的潜在机制。方法:（1）筛选7例NASH患者肝组织标本,9例正常肝组织为对照。通过对NASH人的肝脏组织的常规病理学检查（H&E染色、天狼星红染色）评估NAS评分。行免疫组化及Western Blot和RT-qPCR检测HIFs分别在人类和小鼠NASH（小鼠NASH造模方法同前两部分）肝脏组织中的表达水平。（2）通过慢病毒转染构建稳定低表达HIF-2α的HepG2细胞,以空载慢病毒转染HepG2细胞为对照,分别用PAL诱导HepG2细胞构建体外NASH模型,给予常氧（21%O2）、低氧（5%O2）处理24 h,行油红O检测评估脂质沉积;检测脂肪从头合成相关基因（FAS、ACC1、SCD、SREBP-1c）、NF-κB、炎症因子（TNF-α和IL-1β）和纤维化基因（Collagen I、α-SMA、TGF-β）的表达水平（Western Blot法或RT-qPCR法）。结果:（1）通过NAS活动评分证实本研究所搜集的7例脂肪肝均为NASH。人和小鼠NASH肝脏中HIF-2α的表达水平显著上调,而非HIF-1α。（2）慢性低氧可以上调HIF-2α的在NASH小鼠肝脏中的表达水平;慢性低氧NASH组小鼠的HIF-2α的表达随缺氧时间的延长显著上调。（3）抑制HIF-2α的表达可以下调SREBP-1c介导的DNL相关基因（FAS、ACC1、SCD）、炎症相关基因TNF-α和IL-1β与NF-κB和纤维化相关基因Collagen I、α-SMA和TGF-β的表达。结论:HIF-2α蛋白在人和小鼠NASH肝脏组织中均表达上调,而非HIF-1α。确定了HIF-2α在NASH发病中的作用;并且,HIF-2α的蛋白表达水平可能与NASH的严重程度相关。慢性低氧可以上调HIF-2α在小鼠NASH肝脏组织中的转录水平和蛋白水平。体内、外实验均提示,低氧可以通过上调HIF-2α的表达促进SREBP-1c介导的DNL相关基因（FAS、ACC1、SCD）、炎症相关基因TNF-α和IL-1β与NF-κB和纤维化相关基因Collagen I、α-SMA和TGF-β的表达。干扰HIF-2α的表达可以缓解NASH的脂质沉积、炎症及纤维化