背景：骨肉瘤(Osteosarcoma, OS)在儿童和青少年人群中是最常见的恶性肿瘤之一。从1879年有学者首次报道OS至今,OS的治疗始终是医学界的一个难题。尽管医学进步飞快,现在临床上已有许多新化疗药物用于治疗OS,但OS患者的生存率在过去几十年来一直徘徊不前。自从美国总统奥巴马批准美国国立卫生研究院启动精准医学计划,分子靶向治疗已成为恶性肿瘤患者的新曙光。分子靶向治疗即是针对肿瘤发生、发展与转移等不同环节应用特异性地分子靶向药物如特异性抗体、高选择性抑制剂或高活性调节分子治疗不同类型和不同阶段的恶性肿瘤。这种治疗方法能高效并选择性地杀伤肿瘤细胞,而不良反应轻微。但迄今为止,还没有可用于临床治疗OS患者的分子靶向药物。因此,详细阐明参与OS发生发展的相关信号分子机制、开发新的分子靶向药物成为亟待解决的问题。众所周知,和其他恶性肿瘤一样,OS的发生、发展与原癌基因和抑癌基因密切相关。目前在OS和其他肿瘤中,所有关键抑癌基因中研究最多、最透切的要属p53和Rb基因。p53基因通过调控两个下游基因控制肿瘤细胞的凋亡,它们是bax基因和puma基因。二者均位于细胞质,当肿瘤细胞接收到凋亡刺激信号时,即转位到线粒体,导致细胞色素C释放,启动细胞凋亡程序。p53转录调控的另外一个基因p21,其编码产物是一种核蛋白,是细胞周期中的重要调节因子,可抑制细胞增殖,有研究证实其与OS进展密切相关。但是,p53基因发生缺失突变后,没有抑癌功能；如果发生功能性突变,不但没有抑癌功能,反而会促进肿瘤发生。在OS中,多达一半以上存在p53基因功能性突变,p53等位基因缺失突变发生率还要更高。p53基因容易发生突变或等位基因缺失而丧失抑癌功能,Rb基因在OS中的作用又还没有定论。然而幸运的是,p53基因家族新成员p73基因,其编码产物与p53蛋白结构和功能都非常相似,却极少发生突变或缺失。研究表明p73基因过表达能激活含有p53基因元件所驱动的CAT报告基因的转录,并上调内源性p21、puma、bax基因的表达。因此,p73是一个非常有潜力的OS靶向分子。但p73基因转录表达的蛋白有很多种变体,而其中具有抗癌转录活性的是TAp73。而我们课题组和其他学者研究都发现,TAp73的转录活性和功能在不同的肿瘤中受到很多不同蛋白激酶的修饰调控,影响其抗肿瘤效果。因此,确定催化TAp73发生化学修饰的激酶是一个难点问题,也是一个关键问题。它们将是很有潜力的治疗靶点。现在,生物信息学在生物医学领域的应用给科学研究者们开辟了广阔的前景。另外,生物芯片更是生物信息学在生物学中的又一重要应用。生物芯片是一种高通量检测载体,它可以根据研究目的进行设计,通过样本与芯片杂交获得图像,加工成实验数据,并运用生物信息学方法对实验数据进行可靠性分析,得到大量而准确的实验结果。很多研究者通过生物信息库和预测软件成功预测很多的蛋白修饰过程,并最终通过分子生物学实验验证。因此,生物信息库和相关预测软件是非常好的研究工具,比如蛋白磷酸化预测软件KinasePhos, Scansite, GPS等等。诺贝尔奖获得者W. Gilbert曾经指出,传统生物医学解决科学问题的方式是仅仅通过实验研究：但现在,在人类基因组破译后这种方式将会彻底改变,科学研究将借助生物信息学工具从理论推测出发指导实验研究,然后在实验中去验证或追踪这些理论假设而获得更完整的信息。因此实验研究不再盲目没有方向,不再像是大海捞针。因此,利用生物信息学结合实验研究,将在21世纪取得辉煌成果,也将会创造不可估量的经济和社会效益。本研究拟运用生物信息学工具进行数据分析并结合实验研究,在OS细胞中筛选和验证催化TAp73发生磷酸化修饰的蛋白靶激酶,探索目标靶激酶的生物学功能及其分子机制,初步观察以此为OS分子靶向的治疗效果。目的：观察和了解OS细胞中抑癌基因TAp73及磷酸激酶的表达谱情况,运用生物信息技术总结分析TAp73蛋白活性特点,筛选催化TAp73蛋白发生磷酸化修饰的靶向激酶,进行功能研究和效果验证,为OS分子靶向治疗的研究开发新方法,开拓新思路；也为OS分子靶向治疗的临床应用探索新靶点,并提供理论和实验依据。方法：1.数据分析磷酸化修饰位点对TAp73蛋白功能的调节规律。通过搜索生物信息数据库中已报道过的TAp73蛋白磷酸化修饰的文献数据,分析归纳在不同环境下不同蛋白激酶对TAp73蛋白修饰位点和功能调节的特点、规律。为TAp73蛋白磷酸化后的功能分析提供依据。并采用最新版蛋白磷酸化修饰预测软件Scansite 3.0分析预测已知所有激酶在TAp73蛋白上的潜在磷酸化修饰位点及适用条件。2. cDNA芯片筛选OS细胞中催化TAp73发生磷酸化的靶向激酶。采用体外培养的OS细胞提取细胞总RNA,采用NanoDrop ND-1000对RNA进行定量和质量控制,采用变性琼脂糖凝胶电泳对RNA的完整性进行评估。评估合格后使用ds-cDNA合成试剂盒,利用Oligo(dT)反转引物(100 pmol)将5μg总RNA反转录为双链cDNA (ds-cDNA)。然后对ds-cDNA进行定量分析,再采用单色DNA标记试剂盒对ds-cDNA进行标记。而后取其中4μg标记的ds-cDNA,使用NimbleGen杂交体系在42℃条件下将荧光标记的ds-cDNA与涵盖了45033个来自包括NCBI在内的权威数据库基因的Roche NimbleGen 12 x 135K人类基因表达谱芯片杂交16小时,其后使用相应洗脱液洗涤,最后对杂交芯片进行扫描。将扫描数据按照美国NimbleGen Systems基因表达分析方案进行分析和筛选最有潜力的靶激酶。最后,在体外培养的不同OS细胞系中进行实时逆转录荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative Real-time Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction, RT-qPCR)实验验证芯片筛选结果。3.软件GPS 1.0分析PLK2催化TAp73磷酸化位点及其实验验证。将筛选出的最有潜力的目标靶激酶PLK2运用生物信息软件GPS 1.0分析预测其在TAp73蛋白上的催化位点,并进行功能预测。为后续实验提供方向和理论依据。免疫共沉淀实验(co-immunoprecipitation, Co-IP)定性分析靶向激酶PLK2是否与TAp73发生物理交联,进而用磷酸化蛋白印迹(Western Blot,WB)实验检测PLK2是否催化内源性TAp73发生磷酸化修饰。实验分组包括：空白对照组、空白siRNA对照组、siPLK2处理组、空白siRNA+DNA损伤药物(25 μg/ml,下同)处理组、PLK2抑制剂(5μg/ml,下同)+DNA损伤药物处理组、siPLK2处理组+DNA损伤药物处理组。另一方面,根据磷酸化位点软件预测结果构建TAp73蛋白定点突变表达载体,转染体外培养的OS细胞；同时构建靶向激酶PLK2表达载体,转染OS细胞；将表达蛋白进行免疫提纯后进行体外激酶实验,再用磷酸化蛋白印迹实验检测异位表达的TAp73蛋白磷酸化修饰结果,确定PLK2在TAp73蛋白上的催化位点。4.PLK2对TAp73转录活性影响及其相互作用机制。在OS细胞中进行RT-qPCR和WB实验检测PLK2. TAp73及其下游相关转录基因p21、puma的表达以验证PLK2对TAp73蛋白转录活性的影响;实验分组包括：DMSO对照组、空白siRNA对照组、siPLK2组、PLK2抑制剂组、DNA损伤药物组、目的基因表达质粒转染组、空白siRNA+DNA损伤药物组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物组、siPLK2+DNA损伤药物组、siPLK2+siTAp73+DNA损伤药物组。另一方面,进行蛋白半衰期实验和共聚焦免疫荧光实验检测TAp73与PLK2的相互影响,以期了解二者相互作用的机制；实验分组包括对照组和处理组。5.PLK2与TAp73作用对OS细胞的生理影响及初步动物实验研究。通过对PLK2或TAp73干预观察PLK2通过TAp73对OS细胞生理影响；流式细胞仪(Flow Cytometer, FCM)检测观察PLK2对OS细胞周期进展的影响；CCK-8细胞增殖实验观察PLK2对OS细胞增殖的影响；脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(Terminal Deoxynucletidyl Transferase dUTP Nick End Labeling, TUNEL)实验观察PLK2对OS细胞凋亡的影响；细胞划痕实验观察PLK2对OS细胞侵袭力的影响。实验分组包括：空白对照组、siRNA对照组、siPLK2处理组、PLK2抑制剂处理组、DNA损伤药物处理组、siRNA+DNA损伤药物处理组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物处理组、siPLK2+siTAp73+DNA损伤药物处理组。构建OS的裸鼠实验模型,观察PLK2抑制剂对OS生长的影响和治疗效果,对OS组织样本进行HE染色和免疫组织化学染色,初步观察PLK2抑制剂治疗后OS的病理特点。共3个治疗组实验均采用自身配对设计：分别用DNA损伤药物顺铂(CDDP,25μg/g体重)、CDDP+PLK2抑制剂(5μ g/g体重,下同)、和PLK2抑制剂干预治疗TAp73wt或TAp73nullOS;每个治疗组6只实验鼠。在成功构建实验模型后,测量干预前肿瘤长径a(mm)和短径b(mm),并于干预4周后再次测量肿瘤长径a(mm)和短径b(mm),采用公式V(mm3)=1/2ab2肿瘤体积,比较治疗前后肿瘤体积大小变化；并进行病理活检和免疫组织化学染色初步观察治疗后OS的细胞及分子病理特点,评估PLK2抑制剂的治疗价值,以期为该靶向激酶的最终在临床上应用提供实验依据和方案指导。结果：1.数据分析磷酸化修饰位点对TAp73蛋白功能的调节规律。通过检索三大常用英文生物医学文献数据库即Pubmed、Embase、Ovid数据库和三大中文数据库即万方、维普、以及中国知网中已发表研究TAp73相应氨基残基位点发生磷酸化修饰及其相应磷酸激酶的文献,结合蛋白磷酸化生物信息库PhophositePlus. com中的收录结果,共发现TAp73蛋白上已知磷酸化位点共14个,对应磷酸激酶11个；其中磷酸化修饰位点位于TAp73反式激活域TA1、TA2共5个,位于TAp73非反式激活域共9个；在TAp73反式激活域的磷酸化修饰将下调TAp73的功能活性,而在TAp73非反式激活域的磷酸化修饰均显示上调TAp73功能活性。接着,运用最新版的蛋白磷酸化预测软件Scansite 3.0对TAp73蛋白进行分析,预测所有已知磷酸激酶在TAp73蛋白上潜在的修饰位点。按高度匹配预测结果显示,共有18个潜在磷酸化修饰位点,3个激酶结合位点。18个潜在位点中有酸性激酶催化位点2个,碱性激酶催化位点7个,脯氨酸激酶催化位点2个,其他激酶催化位点7个。除酸性激酶催化位点位于TAp73反式激活域,其余位点分布无明显规律。根据前述总结,酸性激酶的催化位点发生磷酸化修饰将下调TAp73功能活性。2. cDNA芯片筛选OS细胞中催化TAp73发生磷酸化的靶向激酶。Roche NimbleGen 12 x 135K人类基因表达谱芯片涵盖了45033个来自NCBI权威数据库的基因。将芯片扫描数据按照美国NimbleGen Systems基因表达分析方案进行数据质量分析,获得满意结果。人类细胞中已发现磷酸激酶共434种,以标准化表达信号超过200的标准筛选,在OS细胞中有明确表达的269种,其中在细胞膜定位的38种,细胞质定位的77种,细胞核内定位的48种,细胞膜与细胞质定位的24种,细胞核与细胞核质定位的30种,细胞骨架定位的6种,线粒体定位的2种,高尔基体定位的2种,核糖体定位的2种,染色体定位的2种,中心体定位的1种,纺锤体定位的1种,不明确定位的36种。表达丰度最高的10种依次是Casein Kinase 1 (CK1)、Calmodulin 1 (CAML1)、 Casein Kinase 2 (CK2)、Calmodulin 2 (CAML2)、Cyclin-Dependent Kinase 8 (CDK8)、CDC-Like Kinase 3 (CLK3)、Polo-like Kinase 2 (PLK2)、MAP/Microtubule Affinity-Regulating Kinase 2 (MARK2)、Cyclin-Dependent Kinase 4 (CDK4)和Polo-like Kinase 1(PLK1),其中有4种酸性激酶为CK1、CK2、PLK1、PLK2。采用RT-qPCR进一步验证了OS细胞内10种核质内高表达的磷酸激酶的相对表达水平,与芯片筛选基本相符,并发现PLK2在OS细胞内的高表达,且与p53基因状态无关,提示PLK2是有潜力的靶向激酶。3. GPS 1.0软件分析PLK2催化TAp73磷酸化位点及其实验验证。因其他学者和我们课题组先后证实在不同细胞中酸性激酶PLK1和CK2均可磷酸化修饰TAp73蛋白。我们运用polo-like Kinase激酶特异性磷酸化位点预测软件GPS 10对TAp73蛋白序列进行分析预测PLK2的催化位点,按高度匹配结果显示共4个磷酸化修饰位点,2个激酶结合位点。结合前述结果分析,提示位于TAp73反式激活域的T27和S48位点为PLK2最可能的潜在催化位点。基于上述生物信息学数据分析,我们假设在OS细胞中,PLK2催化TAp73蛋白上反式激活域内的T27或S48氨基酸残基发生磷酸化修饰,进而抑制TAp73的功能活性。在OS细胞中蛋白质Co-IP实验显示PLK2和TAp73可发生直接物理结合,并且发现阳性结果与OS细胞中内源性TAp73蛋白丰度有关。而后,磷酸化WB实验检测到发生了磷酸化修饰的TAp73蛋白。另一方面,经构建TAp73蛋白定点突变(丙氨酸残基代替突变位点氨基残基)的表达载体和正常TAp73、PLK2的表达载体进行了体外激酶实验。实验结果也表明PLK2可催化正常TAp73和T27定点突变的TAp73发生磷酸化修饰,而S48位点突变的TAp73蛋白中未能检测到磷酸化TAp73蛋白。因此进一步验证了PLK2可催化TAp73的S48位点发生磷酸化修饰,且是一个新的作用位点。4.PLK2对TAp73转录活性影响及其相互作用机制探讨。上述数据分析和细胞内、外分子生物学实验确定了PLK2可催化高丰度的TAp73发生磷酸化修饰。本部分实验则明确了在OS细胞中PLK2能够抑制TAp73的转录活性、二者在蛋白水平相互作用、相互影响。实验中以DNA损伤药刺激上调内源性TAp73丰度。基因表达水平的RT-qPCR实验结果显示：在正常培养下Saos2细胞中TAp73表达水平低,与正常对照组相比,在用PLK2抑制剂或siPLK2处理抑制PLK2的实验组、以及转染表达载体过表达PLK2(或TAp73)的实验组中TAp73(或PLK2)、p21、puma的mRNA水平无显著差异(P>0.05)；而DNA损伤药物处理组上调内源性TAp73、PLK2后,p21、puma的mRNA水平升高,均有显著差异(P<0.01)。此外,与单纯DNA损伤药物处理组相比,siPLK2+DNA损伤药物处理组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物处理组中p21、puma的mRNA水平升高,有显著差异(P<0.01),但siPLK2+siTAp73+DNA损伤药物处理组则无显著差异(P>0.05)；而在原始表达水平高的MG63细胞中,与对照组相比,单纯PLK2抑制已可见p21、puma表达上调,差异有显著性(P<0.05)。蛋白水平的WB实验结果与RT-qPCR结果基本一致。共聚焦免疫荧光实验结果显示,在OS细胞系Saos2中,在对照组细胞中TAp73和PLK2荧光信号均匀分布于细胞质和细胞核内,而在siRNA沉默PLK2细胞中,TAp73荧光信号则多分布于细胞核内。此外,PLK2半衰期实验检测显示,在对照组细胞中PLK2半衰期约为20分钟,而在稳定沉默TAp73和瞬时转染siTAp73的OS细胞中,PLK2的半衰期均缩短至约为15分钟。5.PLK2与TAp73作用对OS细胞的生理影响及初步动物实验研究。PLK2与TAp73相互作用导致OS细胞生理学改变。细胞周期实验结果显示,与正常对照组相比,在用PLK2抑制剂或siPLK2处理抑制PLK2的实验组中Saos2细胞G1期比例减少,有显著差异(P<0.05)；DNA损伤药物处理组中G1期细胞比例则明显升高,有显著差异(P<0.01)；而与单纯DNA损伤药物处理组相比,siPLK2+DNA损伤药物处理组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物处理组中G1期细胞比例均明显升高,有显著差异(P<0.05)。细胞凋亡实验结果显示,在Saos2和U20S细胞中,与正常对照组相比,在用PLK2抑制剂或siPLK2处理抑制PLK2的实验组中凋亡细胞比例无显著差异(P>0.05)；DNA损伤药物处理组中凋亡细胞比例则明显升高,有显著差异(P<0.01)；而与单纯DNA损伤药物处理组相比,siPLK2+DNA损伤药物处理组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物处理组中凋亡细胞比例均明显升高,有显著差异(P<0.01),但siPLK2+siTAp73+DNA损伤药物处理组差异无统计学意义(P>0.05),而后者与siPLK2 +DNA损伤药物处理组、PLK2抑制剂+DNA损伤药物处理组相比则减少,有显著差异(P<0.01)。在MG63细胞中,则单纯抑制PLK2即可见凋亡细胞比例增加,差异有显著性(P<0.05)。在CCK-8检测细胞增殖实验中,SaOs2细胞结果显示与对照组相比,在用PLK2抑制剂或siPLK2处理抑制PLK2的实验组中光密度值(optical density value,ODV)增加；DNA损伤药物处理组中ODV则在后期明显减少,差异有显著性(P<0.05)。而与单纯DNA损伤药物处理组相比,siPLK2+DNA损伤药物处理组中ODV在后期均明显增加,差异有显著性(P<0.01),而siPLK2+siTAp73 +DNA损伤药物处理组后期ODV增加了,但差异无显著性(P>0.05),但与siPLK2+DNA损伤药物处理组相比则增加有显著差异(P<0.01)。在U20S和MG63细胞中也是类似结果。在细胞划痕实验中,与正常培养的SaOs2细胞相比,单纯抑制PLK2的实验组中创痕消失更快,能在3天内愈合；DNA损伤药物处理组在3天内难以愈合。而siPLK2+DNA损伤药物处理组中创痕不能愈合并出现大量凋亡细胞。但在预先siTAp73处理的SaOs2细胞也能在3天内愈合。细胞实验表明,PLK2可以通过TAp73影响OS细胞生存和增殖。为初步观察在活体水平以PLK2激酶为靶向对OS的治疗效果和了解其病理特征,我们进行了荷瘤鼠治疗实验,对瘤体组织进行了细胞和分子病理学检查。实验结果表明,用CDDP、或CDDP+PLK2抑制剂治疗后,TAp73wt的OS裸鼠上的瘤体体积缩小,差异有显著性(P<0.01),且后一治疗方案使瘤体体积缩小更明显。它们体积治疗前分别为578.200±74.780 mm3,537.976±118.333 mm3,经过治疗后则分别是87.835±31.603 mm3,237.957±122.884 mm3。相反,在TAp73null的Saos2荷瘤鼠上,单纯PLK2抑制剂治疗时,瘤体体积治疗前是628.068±201.036 mm3,治疗后却是2280.518±1050.480 mm3,瘤体仍然在增长,差异有显著性(P<0.01)。这表明通过抑制PLK2可增强顺铂对TAp73wtOS的治疗效果,而在缺乏TAp73蛋白的OS细胞中,单纯用PLK2抑制剂未能观察到治疗效果。细胞病理学HE染色检查见PLK2抑制剂治疗后的TAp73wt的OS细胞比TAp73null形态小,细胞质大而细胞核小,且细胞间结缔多,恶性表型较轻。分子病理学免疫组化染色见PLK2抑制剂治疗有效的OS细胞核内TAp73阳性,且TAp73阳性越强,治疗效果越好。这为最终临床上以PLK2为靶点治疗OS提供了实验基础和指导方案。结论：1.本研究通过医学数据库检索和分析,发现已知14个TAp73磷酸化位点及其对应磷酸激酶；总结已知位点分布特点是位于TAp73反式激活域TA1、TA2共5个,位于TAp73非反式激活域共9个；得出修饰位点磷酸化对TAp73蛋白功能活性的调节规律是：位点在TAp73反式激活域的磷酸化修饰将下调TAp73的功能活性,而位点在TAp73非反式激活域的磷酸化为上调TAp73的功能活性。这对TAp73蛋白化学修饰后的功能预测提供了依据。也给将来利用TAp73作为基因治疗手段提供了思路。2.本研究通过cDNA生物芯片高通量筛选OS细胞内磷酸激酶靶向基因,获得OS细胞内的磷酸激酶表达谱和表达水平较高的10种磷酸激酶,为后续OS分子机制、信号通路等研究提供了平台,并筛选出了4种酸性激酶CK1、CK2、PLK1和PLK2为潜在关键靶激酶,并首次提出PLK2是一个调节TAp73功能活性的关键激酶靶点。3.本研究利用生物信息数据分析形成理论指导实际实验,首次证实了在OS细胞中PLK2可磷酸化高丰度TAp73,并发现了一个新的TAp73磷酸化修饰位点S48。还初步探讨了在OS细胞中PLK2作为肿瘤促进因子的分子机制——通过结合TAp73延长自身半衰期,并阻止转录因子TAp73核转位,下调TAp73转录活性而抑制TAp73下游基因p21, puma表达,从而使细胞快速通过G1期,抑制细胞凋亡,促进细胞增殖和迁徙。因此,PLK2是一个潜在的OS分子治疗靶点。在研究中成功构建OS荷瘤鼠模型,初步观察和总结了PLK2抑制剂治疗后OS的细胞和分子病理学特点。4.本研究发现,DNA损伤药物上调内源性TAp73、PLK2的表达水平后,PLK2可通过高丰度TAp73影响OS细胞生存、生长,并且发现抑制PLK2可挽救TAp73抗OS活性,增强DNA损伤药物CDDP、ADM等的抗肿瘤效果。但在缺乏TAp73蛋白的OS细胞中,单纯用PLK2抑制剂未能观察到治疗效果。这为临床上治疗以TAp73高表达为特征的恶性肿瘤提供了实验基础和指导依据。