研究背景许多疾病的产生与进展均与脂代谢紊乱密不可分,比如肥胖、NAFLD、糖尿病、甚至肿瘤等。肝脏是整个机体脂代谢调控的核心器官,它参与脂质合成、脂质分解及脂蛋白的合成与分泌等重要脂代谢过程,肝脏脂质沉积往往诱发NAFLD。调控肝脏脂代谢的机制非常复杂,包括许多转录因子及其他一些关键调控通路,如固醇调节元件结合蛋白(SREBP-1c),过氧化物酶体增殖激活受体以及PI3K/Akt信号通路及AMPK信号通路等等。研究报道,蛋白激酶Akt直接激活促进脂合成的关键转录因子SREBP-1c,同时激活其下游重要的脂合成酶FASN,SCD-1,ACC1。另一方面,AMPK信号通路能够抑制SREBP-1c的磷酸化,从而抑制其促进脂合成的下游基因的表达,使肝脏脂质合成减少。在正常条件下,脂质的储存和利用参与细胞能量供应稳态的维持。当营养缺乏的时候,细胞储存的甘油三酯(triglyceride,TG)将转变为能够氧化分解提供能量的游离脂肪酸(Free fatty acids,FFAs)。与此同时,细胞对饥饿也会做出相应的反应,如诱导自噬,通过自噬将细胞内的脂滴及衰老细胞器以自噬体的形式运输至溶酶体进行氧化分解。近年来,许多研究发现自噬参与许多脂质沉积相关疾病病理过程。溶酶体是完成自噬降解过程的关键细胞场所,且溶酶体相关膜蛋白LAMPs家族在维持溶酶体正常的酸性环境及其功能中至关重要。研究发现,溶酶体膜蛋白LAMP2在T3诱导的肝脏自噬中明显升高,LAMP2基因缺陷可改善小鼠高脂饮食诱导的肥胖。因此溶酶体相关膜蛋白家族在脂代谢中可能发挥重要作用。内质网是脂合成的主要细胞器,参与肝脏甘油三脂合成的过程。内质网上的一些分子,如SREBP-1c,甘油三磷酸酰基转移酶、甘油二酯酰基转移酶均在TG的合成中发挥重要作用。近年来发现,肥胖会升高肝脏内质网应激水平,而内质网应激与肝脏的脂代谢密切相关。内质网应激的标志分子内质网跨膜蛋白激酶(PERK)及其下游的eIF2a在肥胖小鼠肝脏及肥胖病人中明显升高。并且已有研究发现PERK/eIF2a/ATF4信号通路能促进脂质生成,同时,降低PERK也能抑制脂质合成的关键酶FASN、ACL、SCD-1的表达。近年来发现,缺氧诱导的内质网应激通过PERK/eIF2/ATF4通路显著激活溶酶体相关膜蛋白家族中的LAMP3。LAMP3既往研究主要发现集中在与乳腺癌、膀胱癌及食管癌等肿瘤的预后相关性上,但LAMP3在肝脏脂代谢中是否也发挥作用尚不清楚。目的本研究的目的在于揭示LAMP3在肝脏脂代谢中的作用及机制,为肝脏脂代谢紊乱的临床治疗提供新的思路。方法1、HE染色观察NAFLD患者,高脂喂养鼠、ob/ob肥胖小鼠及各自对照组肝脏组织学表现。2、使用qRT-PCR和/或蛋白免疫印迹(Western blotting)法在正常人与非酒精性脂肪肝病人肝脏、高脂饮食诱导的肥胖小鼠及瘦素基因缺陷的肥胖小鼠模型的肝脏中检测LAMP3表达情况。此外,使用FFAs处理3种肝细胞系HepG2、Huh7、QGY-7703,24h后检测LAMP3表达变化。3、过表达LAMP3及使用FFAs处理肝细胞24h后,使用油红染色法检测细胞内的脂滴沉积情况;同时用TG、ATP、β-羟基丁酸检测试剂盒检测细胞内TG及ATP的生成。4、在FFAs处理及LAMP3转染后的HepG2细胞中使用qRT-PCR法检测脂质合成指标FASN、SCD-1及脂质分解指标CPT-1A、PGC-1α、ACOX1表达。5、过表达LAMP3后使用Western blotting及Lyso-tracker溶酶体标记检测调控参与脂代谢的重要机制,如自噬过程与促进脂质生成的PI3K/Akt信号通路。另外,在相同的条件下使用特异性抑制剂抑制PI3K/Akt信号通路的后,再用TG检测试剂盒检测细胞内TG的变化。结果1、与对照组相比,非酒精性脂肪肝病人,高脂喂养鼠及ob/ob鼠肝脏呈现弥漫分布的空泡状结构,肝细胞排列紊乱。2、LAMP3在非酒精性脂肪肝病人组、高脂诱导的肥胖小鼠模型组(HFD、ob/ob小鼠)的肝脏中均比各自对照组明显升高。同样地,FFAs处理后的肝细胞LAMP3表达也显著升高。3、油红染色发现在FFAs处理后,LAMP3过表达引起肝细胞内的脂滴明显增多,细胞内的TG水平也显著升高。但是,脂质分解过程产生的的β-羟基丁酸、ATP水平无明显变化。4、HepG2细胞过表达LAMP3后,脂质合成重要基因FASN、SCD-1表达升高,而分解相关基因CPT-1A、PGC-1α、ACOX1表达无明显变化。5、最后,我们发现,LAMP3过表达后,自噬标志物p62、LC3、Beclin1无明显变化,溶酶体数量也无明显改变。但是p-Akt(S473)则明显激活,且抑制PI3K/Akt通路可以部分降低LAMP3诱导的TG沉积。结论1、在非酒精性脂肪肝病人及动物模型肝脏组织中,LAMP3表达显著上调;同时高脂处理可显著诱导肝癌细胞中LAMP3的表达。2、LAMP3过表达显著促进FFAs诱导的肝细胞脂质沉积,对肝细胞脂质分解无明显作用。3、LAMP3过表达促进肝细胞脂质合成基因表达,对脂质分解相关基因无明显作用。4、LAMP3可能通过激活PI3K/Akt信号通路促进肝细胞内脂质沉积。