论文部分内容阅读
目的：将在细胞的运动、生长、发育和信号通路等多个方面发挥重要作用的WD40蛋白家族作为研究的对象，从GenBank中现有的日本血吸虫基因数据库中筛选了功能尚未证实的WD40蛋白家族成员SjWD40，对该基因的结构和功能进行生物信息学预测，并通过基因工程的方法获得重组蛋白，制备特异性抗体，对该基因在血吸虫不同阶段的表达和组织定位进行研究，确定它在虫体哪个组织器官中表达，初步推测它主要在哪方面发挥生物学功能，并评价该重组蛋白是否具有免疫学价值。
方法：SjWD40基因的生物信息学分析；SjWD40基因的克隆、表达及免疫学特性分析；SjWD40在虫体的各个阶段和组织中表达的研究。
结果：①SjWD40基因的生物信息学分析。Blastx分析该基因具有完整的开放阅读框，基因全长1086bp，编码区为66-950，起始密码为ATG，终止密码为TAA，编码294个氨基酸，理论分子量和等电点分别是31.8kDa和6.44。PredictProtein预测该序列二级结构中α螺旋(H)、β折叠(E)和无规则卷曲(L)的比例分别是0:55.78:44.22。Motifscan预测该蛋白含有一个可能的糖基化位点，1个CAMP磷酸化位点，3个潜在的酪蛋白激酶Ⅱ(CK2)磷酸化位点，2个潜在的蛋白激酶C(PKC)磷酸化位点，1个酪氨酸激酶磷酸化位点，9个潜在的N—肉豆蔻酰位点。InterProScan显示该蛋白含有6个WD40结构域，推测其可能是WD40蛋白家族中的一员，参与调节各种细胞功能，如信号传导、转录调节、细胞增殖等方面起到重要的作用。②SjWD40基因的克隆、表达及免疫学特性分析。设计引物从日本血吸虫cDNA中扩增SjWD40目的片段，用琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA条带在885bp左右，定向克隆获得的重组原核表达质粒pET—28a(+)—SjWD40经PCR、双酶切和测序鉴定后证实重组质粒构建成功。重组质粒在IPTG诱导下表达重组蛋白，经SDS—PAGE显示与理论预测的融合蛋白分子量相符，表达产物经变性、亲和层析纯化，获得日的蛋白。③SjWD40在虫体的各个阶段和组织中表达的研究。提取日本血吸虫雌虫、雄虫、虫卵、尾蚴的总RNA并反转录合成相应的cDNA，采用RT—PCR对SjWD40编码基因在不同虫期的相对表达水平进行分析。实验结果显示，SjWD40基因在不同发育期均有转录，且转录水平无明显差异。
结论：⑴从GenBank中现有的日本血吸虫基因数据库中筛选了功能尚未证实的WD40蛋白家族成员SjWD40，该蛋白含有6个WD40结构域，属于WD蛋白家族中的一员，利用基因工程技术成功构建了pET—28a(+)—SjWD40原核表达载体，得到纯化的重组蛋白。⑵Western Blotting结果表明该重组蛋白具有较强的免疫原性和免疫反应性。应用ELISA方法，比较重组抗原和成虫粗抗原检测日本血吸虫病人血清IgG敏感性表明，该重组蛋白与粗制的SjAWA具有相似的敏感性、特异性和交叉反应性，提示rSjWD40抗原可以用作日本血吸虫病的诊断抗原。⑶SjWD40在日本血吸虫生活史各时期均有表达，定位于日本血吸虫成虫的卵黄腺和睾丸，虫卵的毛蚴体壁，尾蚴的头腺和钻腺，表明该蛋白与虫体的生殖发育和运动有关，提示其在抗生殖、抗感染方面具有较好的应用前景，是具有重要研究价值的虫源性免疫分子，为探讨其在生长发育和致病过程中所起的作用奠定基础。