论文部分内容阅读
目的及意义结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是最常见的消化道恶性肿瘤之一,无论是在全世界还是我国,其发病率和死亡率均较高[1,2]。2019年我国最新的癌症统计数据显示结直肠癌在我国恶性肿瘤发病率中排在第三位,而死亡率排在第五位。因此,探寻结直肠癌发生发展过程中某些重要的基因,并对其功能及相关分子机制进行深入的研究,具有至关重要的临床意义。已有大量研究表明在儿童低级别胶质瘤中KIAA1549基因与BRAF基因互相融合,在胶质瘤的发生和发展过程中起重要作用[3-17]。还有研究也证实了在乳腺叶状恶性肿瘤中也可检测到KIAA1549与BRAF相互融合[18]。但是,在其他恶性肿瘤中,目前仍未见到KIAA1549基因相关的研究及文章报道。结合本课题组前期研究对结直肠癌及配对的癌旁组织（3v3）进行的表达芯片分析结果,提示KIAA1549基因在结直肠癌组织中相较于癌旁组织显著高表达,因此,本研究拟检测KIAA1549基因在结直肠癌中的表达情况,探索其功能及相关的分子机制,以期为结直肠癌患者的治疗提供新的治疗靶点及理论依据。材料及方法1.生物信息学方法分析结直肠癌中KIAA1549基因的表达情况;荧光实时定量PCR、Western blot及免疫组化等方法检测KIAA1549在结直肠癌的细胞系、新鲜组织以及石蜡切片中的表达情况,并分析KIAA1549的表达与患者预后的相关性;2.构建KIAA1549稳定过表达/敲低的结直肠癌细胞株,进行CCK8、平板克隆形成以及裸鼠皮下成瘤实验检测稳定过表达/敲低KIAA1549细胞株的体内、体外增殖能力的变化,Transwell实验检测稳定细胞株的体外迁移能力的变化;3.通过流式细胞技术检测过表达/敲低KIAA1549后细胞周期和凋亡的变化;并应用5-氟尿嘧啶及奥沙利铂诱导细胞凋亡,进行流式细胞技术检测过表达/敲低KIAA1549细胞株的抗凋亡能力变化;4.CCK8检测过表达/敲低KIAA1549后化疗药物对结直肠癌细胞半数抑制浓度IC50的影响,平板克隆形成实验检测过表达/敲低KIAA1549后化疗药物对结直肠癌细胞株克隆形成的影响;5.GEO数据库下载结直肠癌的基因芯片,用GSEA通路富集方法进行通路富集,把每个芯片富集到P值小于0.05的通路进行交集,得到相对应的通路,并查找此通路关键的蛋白分子。应用生物信息学分析此蛋白与KIAA1549之间的相关性;通过数据库分析 ERCC2及联合KIAA1549＆ERCC2与结直肠癌患者预后的关系;6.构建ERCC2/XPD稳定敲低细胞株,并进行功能回复检测。结果1.生物信息学分析发现KIAA1549基因在结直肠癌组织中的表达显著高于相对应的癌旁组织;实时荧光定量PCR及Western blot结果显示:KIAA1549无论是mRNA水平还是蛋白水平在多种结直肠癌细胞株中的表达均有不同程度的上调;24对结直肠癌组织中有18对的mRNA表达水平高于相对应的癌旁组织,8对结直肠癌组织中有6对癌组织中的KIAA1549蛋白表达水平高于相对应的癌旁组织;80例结直肠癌石蜡切片,免疫组化结果显示KIAA1549在82.5%的肿瘤组织中高表达,而正常组织中仅37.5%高表达。采用Kaplan-meier法进行生存分析显示结直肠癌组织中KIAA1549高表达组总生存及无复发生存率均显著低于低表达组。2.成功构建KIAA1549稳定过表达/敲低的结直肠癌细胞株,过表达KIAA1549后结直肠癌细胞的增殖、迁移及克隆形成较对照组显著增强;裸鼠皮下成瘤的体积及重量较对照组大;细胞周期检测:G1期细胞减少,S期+G2期细胞增多,增殖指数PI较对照组高;CCND1、CCNE1及MDM2表达上调,P21及P53表达下降;而敲低了 KIAA1549后结直肠癌细胞体外的增殖、迁移及克隆形成较对照组明显减弱;裸鼠皮下成瘤的体积及重量较对照组低;细胞周期检测:G1期细胞增多,S期+G2期细胞减少,增殖指数PI较对照组低,CCND1、CCNE1及MDM2表达下降,P21及P53表达上调。3.KIAA1549过表达/敲低组细胞的凋亡率与对照组细胞无差别,应用5-氟尿嘧啶或奥沙利铂诱导凋亡后,KIAA1549过表达组凋亡率较对照组明显减少,而KIAA1549敲低组的凋亡率较对照组明显增加。4.过表达KIAA1549后结直肠癌细胞对5-FU及奥沙利铂的IC50上升;而敲低KIAA1549后结直肠癌细胞株对5-氟尿嘧啶及奥沙利铂的IC50下降。5.GSEA通路富集方法对GEO数据库里的3个结直肠癌芯片进行通路富集后相互交集,筛选出核苷酸切除修复（Nucleotide excision repair,NER）通路,并查找到此通路关键的蛋白分子为ERCC2/XPD基因。生物信息学分析显示KIAA1549与ERCC2/XPD基因成正相关。对结肠癌基因表达数据GSE39582（n=585）进行生存分析发现ERCC2高表达的患者预后较低表达患者更差,并且在接受了化疗的患者中（n=167）,ERCC2高表达的患者提示预后不良,同时亚组分析结果也提示ERCC2highKIAA1549high组患者的总生存率最差。6.敲低ERCC2/XPD后,结直肠癌细胞株的增殖能力减弱,细胞对化疗药物更加敏感,细胞的凋亡率明显增加。结论1.KIAA1549在结直肠癌细胞及组织中高表达,其表达水平同临床预后相关。2.KIAA1549可发挥促结直肠癌细胞增殖、迁移、周期进展及抑制凋亡的功能。3.KIAA1549可介导结直肠癌细胞对化疗药物5-FU及奥沙利铂的耐药。4.ERCC2/XPD与结直肠癌病人及接受化疗病人的不良预后相关,且其为KIAA1549的关键功能下游。