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DNA氧化损伤与衰老、疾病、癌症以及环境当中所存在的有害物质有着毋庸置疑的联系,8-羟基脱氧鸟苷(8-hydroxy-2’deoxyguanosine,8-OHdG)是DNA氧化损伤产生的加合物,由于8-OHdG在人体中不能进一步代谢,从而会分散在血液和尿液中。因此8-OHdG也就成为预防疾病,提前预防癌症发生的主要标志物。研发8-OHdG新的定量分析检测方法也显得尤为重要。本论文基于不同的传感模式和化学发光机理构建了不同的8-OHdG定量检测方法。在创建检测组氨酸的传感器基础上进行改良,以磁性微球作为固定分离载体,实现传感器和其他杂质的快速分离,达到快速准确分析8-OHdG。本论文主要分为以下三个部分:
第一部分主要是基于镍纳米粒子催化鲁米诺在NaOH碱性溶液中产生瞬时化学发光的原理,以磁性微球作为固定分离载体,将组氨酸包裹于磁性微球表面,通过镍纳米粒子与组氨酸络合作用将镍纳米粒子固定在磁性微球上,从而构建了一种检测组氨酸的传感器,应用化学发光法(CL)实现了组氨酸的定量检测。其中随着组氨酸的浓度逐渐增大,所制备的传感器产生的CL就越高,相对于空白组(未加入组氨酸)的CL值,引起的CL变化量(?CL)就越大。在优化实验条件之后,当组氨酸浓度在1×10-5~5×10-2mg/mL范围内,?CL信号值与组氨酸各浓度的对数值经过计算拟合后表现出良好的线性关系(Y=40236x-25758,R2=0.9935),且最低检测限达到2.21ng/mL。
第二部分同样采用镍纳米粒子催化鲁米诺在NaOH碱性溶液中产生瞬时化学发光的原理,结合适体特异性检测技术,建立了一种无标记适体传感器,实现了8-OHdG的定量检测分析。该方法以磁性微球作为快速分离的载体,将捕获探针DNA固定于磁性微球表面作为固定相,8-OHdG适体与组氨酸交联后再与镍纳米粒子螯合,利用8-OHdG和适体之间的特异性结合的特性,捕获探针将与8-OHdG竞争结合适体,从而得到8-OHdG浓度和镍纳米粒子的关系,而镍纳米粒子与化学发光值呈一定的相关性,因此8-OHdG浓度就与化学发光值相关。在优化实现条件下,当8-OHdG浓度在0.01ng/mL~10ng/mL范围之间,?CL信号值与8-OHdG浓度的对数值呈现良好的线性关系(Y=30113x-17236,R2=0.9934),且最低检测限为0.0098ng/mL。经考察发现,该方法能够实现8-羟基脱氧鸟苷的特异性检测。
第三部分采用辣根过氧化物酶(HRP)化学发光体系,同样以磁性微球为固定分离载体,利用芬顿(Fenton)试剂氧化富含G碱基DNA产生8-羟基脱氧鸟苷,结合抗原抗体组建化学发光免疫传感器。该方法采用Fenton试剂的强氧化性将提前固定在羧基磁性微球表面的DNA氧化而造成损伤产生8-OHdG,然后利用8-OHdG抗体特异识别DNA上产生的8-OHdG,最后通过标记有HRP的IgG与8-OHdG抗体杂交实现8-OHdG的检测。实验结果显示,Fenton试剂用量在优化条件下最低能达到10nmolFe2+/20nmolH2O2,且通过加入抗氧化剂能够有效地降低DNA的氧化损伤程度,其中白藜芦醇和原花青素的抗氧化能力较好。用几种水环境中的污染物对DNA进行氧化损伤测试后,结果发现重金属离子中的Cr6+对DNA造成的氧化损伤较大。
第一部分主要是基于镍纳米粒子催化鲁米诺在NaOH碱性溶液中产生瞬时化学发光的原理,以磁性微球作为固定分离载体,将组氨酸包裹于磁性微球表面,通过镍纳米粒子与组氨酸络合作用将镍纳米粒子固定在磁性微球上,从而构建了一种检测组氨酸的传感器,应用化学发光法(CL)实现了组氨酸的定量检测。其中随着组氨酸的浓度逐渐增大,所制备的传感器产生的CL就越高,相对于空白组(未加入组氨酸)的CL值,引起的CL变化量(?CL)就越大。在优化实验条件之后,当组氨酸浓度在1×10-5~5×10-2mg/mL范围内,?CL信号值与组氨酸各浓度的对数值经过计算拟合后表现出良好的线性关系(Y=40236x-25758,R2=0.9935),且最低检测限达到2.21ng/mL。
第二部分同样采用镍纳米粒子催化鲁米诺在NaOH碱性溶液中产生瞬时化学发光的原理,结合适体特异性检测技术,建立了一种无标记适体传感器,实现了8-OHdG的定量检测分析。该方法以磁性微球作为快速分离的载体,将捕获探针DNA固定于磁性微球表面作为固定相,8-OHdG适体与组氨酸交联后再与镍纳米粒子螯合,利用8-OHdG和适体之间的特异性结合的特性,捕获探针将与8-OHdG竞争结合适体,从而得到8-OHdG浓度和镍纳米粒子的关系,而镍纳米粒子与化学发光值呈一定的相关性,因此8-OHdG浓度就与化学发光值相关。在优化实现条件下,当8-OHdG浓度在0.01ng/mL~10ng/mL范围之间,?CL信号值与8-OHdG浓度的对数值呈现良好的线性关系(Y=30113x-17236,R2=0.9934),且最低检测限为0.0098ng/mL。经考察发现,该方法能够实现8-羟基脱氧鸟苷的特异性检测。
第三部分采用辣根过氧化物酶(HRP)化学发光体系,同样以磁性微球为固定分离载体,利用芬顿(Fenton)试剂氧化富含G碱基DNA产生8-羟基脱氧鸟苷,结合抗原抗体组建化学发光免疫传感器。该方法采用Fenton试剂的强氧化性将提前固定在羧基磁性微球表面的DNA氧化而造成损伤产生8-OHdG,然后利用8-OHdG抗体特异识别DNA上产生的8-OHdG,最后通过标记有HRP的IgG与8-OHdG抗体杂交实现8-OHdG的检测。实验结果显示,Fenton试剂用量在优化条件下最低能达到10nmolFe2+/20nmolH2O2,且通过加入抗氧化剂能够有效地降低DNA的氧化损伤程度,其中白藜芦醇和原花青素的抗氧化能力较好。用几种水环境中的污染物对DNA进行氧化损伤测试后,结果发现重金属离子中的Cr6+对DNA造成的氧化损伤较大。