研究背景　　越来越多的研究表明自噬抑制剂（autophagy inhibitor)可以协同增强化疗药物对肿瘤细胞的抑制作用。但目前自噬抑制剂的种类并不多且大多作为研究工具使用，能应用于临床治疗的极少。因此筛选寻找新的自噬抑制剂，阐明其作用机制，为临床开发低毒高效的抗肿瘤药物增敏剂具有重要意义。从天然产物中筛选药物是药物研发的一个重要手段，“老药新用”也是药物研发的一种重要策略，因此从天然产物或从临床已使用的“老药”中寻找筛选新的自噬抑制剂是一种可行的方法。来自于中草药黄芦木根中的盐酸小檗胺（Berbamine Hydrochloride，BBM)）是一种已在临床使用多年的升白细胞药物，我们在研究中发现盐酸小檗胺可以阻断乳腺癌细胞的自噬降解过程，并能协同多柔比星增强其抑制乳腺癌细胞活性的作用。因此作为来自天然产物且在临床应用多年的“老药”，盐酸小檗胺有开发成抗肿瘤药物增敏剂的潜能。本论文对盐酸小檗胺阻断自噬降解及其增强多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的具体机制进行了深入地研究探讨。　　研究目的　　本论文拟深入研究盐酸小檗胺阻断乳腺癌细胞自噬降解的作用靶点及机制，探讨盐酸小檗胺协同增敏多柔比星抑制乳腺癌细胞活性的作用机制，为新型自噬降解抑制剂的研发提供新的思路，同时也为将盐酸小檗胺联合多柔比星用于乳腺癌治疗提供理论依据。　　研究方法　　采用噻唑蓝(MTT)法检测细胞的增殖活性；采用免疫印迹法(Western blot)检测细胞的蛋白表达水平；采用免疫共沉淀法(Co-IP)检测蛋白的相互结合；采用免疫荧光(IF)及激光共聚焦方法(Confocal)观察自噬体及蛋白共定位等；采用流式细胞仪(Flow cytometry)检测细胞凋亡及ROS。　　研究内容和结果　　1．盐酸小檗胺可阻断乳腺癌细胞的自噬降解　　盐酸小檗胺(BBM)可明显增加乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞中自噬小体的数量；增加自噬标志蛋白LC3B-II及自噬受体蛋白SQSTM1/P62的表达，但并不影响促进自噬体形成的关键蛋白的表达。而BBM与Bafilomycin A1（Baf，自噬降解抑制剂）一样可以增强Rapamycin（Rapa，自噬诱导剂）导致的LC3B-II增多，逆转Rapa导致的 SQSTM1/P62 下降，表明 BBM 可能阻断了自噬的降解过程；最后我们通过 tfLC3双荧光质粒转染实验，确证BBM阻断了乳腺癌细胞的自噬降解过程。　　2. 盐酸小檗胺通过干扰SNAP29-VAMP8的结合而抑制自噬体-溶酶体的融合　　BBM 既不破坏溶酶体的酸性环境也不降低溶酶体膜标志蛋白 LAMP1/LAMP2 的表达，但可抑制自噬体与溶酶体的融合。进一步研究发现BBM可干扰SNAP29-VAMP8之间的结合，影响了自噬体-溶酶体融合所必需的SNARE蛋白复合物的形成，从而抑制自噬体-溶酶体的融合而阻断自噬降解。　　3. 盐酸小檗胺通过上调BNIP3表达干扰SNAP29-VAMP8的结合　　BBM可以增加BNIP3的mRNA转录水平及上调BNIP3蛋白的表达；采用shRNA干扰的方法敲降BNIP3后，可减轻BBM对SNAP29-VAMP8结合的干扰，减弱BBM对自噬体-溶酶体融合的抑制作用进而削弱BBM阻断自噬降解的作用。　　4. BNIP3通过与SNAP29直接结合而干扰SNAP29-VAMP8的结合　　免疫共沉淀实验发现 BNIP3 与 SNAP29 可以发生共沉淀，免疫荧光检测发现BNIP3 可以与 SNAP29 发生共定位；而过表达 SNAP29 可以减轻 BNIP3 对SNAP29-VAMP8结合的干扰，促进自噬体-溶酶体融合，最终削弱BNIP3阻断自噬降解的作用。　　5．过表达BNIP3可干扰SNAP29-VAMP8的结合，抑制自噬体-溶酶体融合。　　过表达BNIP3可干扰SNAP29与VAMP8的共定位，抑制自噬体-溶酶体的融合，阻断自噬降解，导致自噬体堆积。且对雷帕霉素诱导的自噬有明显的阻断作用。　　6．盐酸小檗胺可协同增敏多柔比星促进乳腺癌细胞凋亡　　MTT检测发现BBM可以抑制不同类型肿瘤细胞的增殖活性，也可协同增敏多种抗肿瘤药物的抗乳腺癌细胞作用；其中对多柔比星（DOX）的增敏作用最强；流式细胞和Western blot检测发现BBM联用DOX (BBM+DOX)可增加乳腺癌细胞的凋亡率，激活细胞凋亡途径；进一步的分子机制研究发现BBM+DOX可能通过影响p38、ERK等MAPK信号通路蛋白的磷酸化水平而导致细胞凋亡。　　7. 盐酸小檗胺增敏多柔比星诱导乳腺癌细胞产生ROS而促进细胞凋亡　　流式细胞仪检测发现BBM+DOX可以诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞产生活性氧(ROS)；进一步研究发现 BBM+DOX 诱导产生的 ROS 为超氧阴离子（ O2-）；采用Mn-TBAP抑制ROS可以减轻BBM+DOX对p38、ERK等蛋白磷酸化水平的影响，减少凋亡相关蛋白的表达；也明显降低了BBM+DOX诱导的细胞凋亡并减弱BBM+DOX抑制MDA-MB-231细胞增殖活性的作用。　　8. 盐酸小檗胺通过阻断自噬降解，导致自噬体过度聚集而增强多柔比星的抗乳腺癌细胞作用　　采用 3-MA 抑制细胞自噬体的形成可减少 BBM+DOX 诱导产生的 ROS，减轻BBM+DOX对p38、ERK等蛋白磷酸化水平的影响，减少凋亡相关蛋白的表达；也明显降低BBM+DOX诱导的细胞凋亡并减弱BBM+DOX抑制MDA-MB-231细胞增殖的作用。　　结论　　1.盐酸小檗胺是一新型的自噬降解抑制剂。其通过上调 BNIP3 表达，干扰SNAP29-VAMP8 结合，从而抑制自噬体-溶酶体融合，进而阻断自噬降解，最终导致乳腺癌细胞中自噬体大量堆积。　　2.盐酸小檗胺可作为一种新的抗肿瘤药物增敏剂，其通过抑制自噬降解导致自噬体大量堆积，从而协同多柔比星诱导细胞出现氧化应激反应产生ROS，进而影响p38、ERK 等 MAPK 信号通路蛋白的磷酸化水平而激活细胞凋亡途径，促进乳腺癌细胞发生凋亡而抑制其增殖活性。